第五节 癌胚抗原的免疫细胞化学

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一、癌胚抗原的特点

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)是分子量约20万的糖蛋白,具有二级以上结构。不同肿瘤中提取的CEA虽然抗原性相似,但所含唾液酸及其它糖组分的含量不一定相同,故有多个抗原决定簇,能与非特异性反应抗原NCA、NCA-2和正常胎儿粪抗原等发生交叉反应。NCA存在于正常肺、胰腺、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞内,也存在于正常肠粘膜、胃粘膜肠化生腺体细胞及胆汁内。临床血清学检查CEA对结肠癌肺癌胰腺癌胃癌及其它腺上皮性恶性肿瘤等的诊断有较大价值。免疫细胞化学研究可以明确CEA的定位和分布,也可以通过组织切片和分泌物涂片进行临床诊断和鉴别诊断。

二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色

1.组织加工有人提出用冰冻切片进行CEA免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件,有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看,福尔马林固定后的切片CEA的部分抗原决定簇被遮盖,阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片,CEA的阳性率明显升高,而且结果仍很清晰。goldenbery等同时进行CEA酶标记组织,而福尔马林固定的组织切片中CEA检出范围为3.0~7.0ng/g组织,酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感2~3倍。有趣的是我们用酒精固定26个月的切片进行染色,效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显,但不影响组织结构及形态,而且可以进行多种抗原的定位研究,操作简单,是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。

2.染色方法的选择根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP和ABC技术可以采用,但试剂价格较昂贵,步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下:

(1)冷酒精固定的组织石蜡包埋,组织切片,常规脱蜡后在PBS中放置5min,过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干,加含3%H2O2甲醇一滴在切片上,放置20min后再PBS冲洗3次,过蒸馏水后风干。

(2)加稀释好的兔抗CEA血清(稀释度根据染色工作效价)在37℃湿盒内放置45min。

(3)PBS清洗3次后风干,再加HRP标记物的羊抗兔IgG(稀释度也要根据染色工作效价),37湿盒内放置45min。

(4)PBS清洗3次后加新鲜配制的含3%H2O2pH7.6Tris缓冲液(10ml溶液中含二氨基联苯胺5mg)中暗处反应5~8min(边反应边在显微镜下观察),自来水冲洗,用1%甲基绿复染2~5min,再次自来水冲洗,常规脱水、透明和封片,在光镜下观察。

3.阳性结果判断及计数检查前应当对CEA的分布有一定理性认识,而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA以三种形式出现在胃肠道组织切片中:①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的CEA分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中,CEA多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有CEA着色。

4.腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取200~300ml腹水,离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是:在腹水涂片上加兔抗CEA抗血清(1:25稀释,稀释液为BPS缓冲液),在37湿盒内放置45min后BPS冲洗,共10min,再加入FITC标记的羊抗兔IgG(1:20稀释,稀释液为0.1%伊文氏蓝缓冲液),在37℃湿盒内放置45min后,PBS冲洗3次,共10min,用50%甘油封片,荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行HE染色,做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色(方法同T淋巴细胞染色)。我们发现,不论采用哪种方法,都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚,如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色,可明显减少非特异性荧光,而且淋巴细胞较小,腺癌细胞较大,有利于进行鉴别诊断。

三、临床意义

免疫细胞化学技术可以确定CEA的组织发生部位,根据阳性特点可以判断癌细胞的位置。我们的研究发现正常结肠组织CEA为弱阳性,多非常清晰分布在腔面。但结肠癌组织中CEA着色带较宽,多为强阳性,而且不规整。对胃粘膜的研究发现正常胃腺体均为阴性,肠化生腺体细胞弱阳性。胃腺瘤细胞也含有CEA。70%以上胃癌细胞CEA强阳性,特别是粘液细胞癌,光镜下癌细胞分散浸润,无法确定其转移及浸润范围。用免疫荧光或免疫酶技术进行染色,根据阳性细胞分布可作出正确判断。在肝脏或其它部位转移癌有时因细胞分化不良,无法确定其组织来源。如果用免疫细胞化学染色,发现CEA阳性细胞说明来源于腺上皮的癌肿,可能来自胃肠道或卵巢等组织。用胸腹水进行免疫细胞化学染色对临床诊断有实用价值。Walts对26例肿瘤病人渗出液和抽吸液离心后做免疫酶染色,发现13例有CEA阳性细胞。11例常规细胞学检查阴性的肿瘤病人发现8例胸腹水中有CEA阳性细胞。如果胆高CEA抗体的特异性,改进组织加工方法,排除非特异性着色,可望提高诊断价值。已经有人在血清学监测CEA诊断胃肠道肿瘤的基础上,将CEA标记125I进行放射扫描定位诊断和用CEA标记131I或抗癌药物进行肿瘤治疗的报道。

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