第二节 胃肠道粘膜抗体产生细胞

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一、抗体产生细胞的特点

抗体产生细胞(Antibody – producing cell)即光镜下所见浆细胞。有的呈圆形,核居中(称之为淋巴样浆细胞、幼浆细胞或过渡型浆细胞),也有的呈椭圆形,核偏于一边(称为典型浆细胞)。它们都具有丰富胞浆(HE染色呈红色),能产生和分泌各种抗体。一个成熟浆细胞只能分泌一种抗体。胃肠道粘膜中的各种抗体多由局部抗体产生细胞所分泌。一般认为骨髓的多潜能干细胞转化成细胞表面具有IgM和IgD标记的成熟B淋巴细胞后进入粘膜层或粘膜下层的散在淋巴滤泡或Peyer斑的生发中心。胃肠腔内抗原通过其靠腔面的M细胞进入粘膜固有层,通过巨噬细胞和树突状细胞将抗原加工后传递至生发中心,在转化生长因子β(β-trans-forming growth factor, TGF-β)、IL-4、IL-5、γ-IFN和抗原刺激下B淋巴细胞增殖并转移化成细胞表面含IgG、IgA、IgE等特异性B淋巴母细胞,一部分直接分散在固有层,大部分经淋巴细胞再循环返回胃肠道粘膜,在IL-2和IL-6刺激下转化成抗体产生细胞,分泌特异抗体,发挥体液免疫反应。因此测定粘膜中抗体产生细胞的分布对进一步认识局部体液免疫反应与胃肠道疾病的关系有重要意义。

二、双标记免疫荧光染色

抗体产生细胞胞浆内含有相对多的抗原,故采用直接或间接法免疫细胞化学技术可简化步骤,节 省时间,降低成本。为了清除组织间弥散的免疫球蛋白,我们在固定前用PBS浸洗,取得良好的效果。用双标记免疫荧光技术可以在同一张切片上显示出两种不同的抗体产生细胞。

1.组织加工根据研究目的的内窥镜直视下钳取胃、小肠或结肠粘膜。将取得的组织立即放入含4,pH7.2、0.01mol/l PBS烧杯内搅拌10~18h后直接放入4℃、96%乙醇中固定。在4℃环境下继续脱水和透明,56℃浸蜡和包埋,石蜡块冰箱保存。组织切片后,37℃温水展平,载片后干燥,装干燥盒置于冰箱,可以保存1周左右。4脱蜡和脱二甲苯,PBS洗涤后蒸馏水清洗,风干待染。

2.荧光素标记抗体  异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocynate, FITC)标记抗体的具体步骤详见第三章 。在标记络丹明B200(lissamine rhodamin B200,RB200)时应注意:

(1)PCI5极易吸收水份放出烟雾样刺激气体,RB200和丙酮混合后搅拌时也放出有毒的SO2Cl刺激性气体,故操作时最好在通风橱内进行。在室外操作时应戴口罩。

(2)丙酮极易挥发,一定要在密闭容器(如带盖的青霉素瓶)内搅拌。吸取丙酮时也要动作迅速。

(3)在标记过程中,RB200能产生HCl,容易使蛋白变性,必须用较多碱性缓冲液中和。具体步骤是:

①按50mg蛋白需10mg RB200和20mg PCI5的比例分别准确称取PCl5和RB200,放入青霉瓶内。经橡皮塞穿入玻棒拌混合5min。

②用吸管吸取0.5ml左右丙酮迅速注入瓶内,继续搅拌5min形成紫褐色溶液(A液)。

③1份抗血清(含蛋白10~20mg/ml)用等量或2份0.5mol/l p9.5碳酸缓冲液稀释后在4冰箱内用磁力搅拌器边搅边加入A液,并用混合液反复冲洗青霉素瓶内的A液,直至干净为止,然后继续搅拌30~60min。

④称取相当于蛋白半量的活性碳加入混合液内继续搅拌60min后,以4000r/min离心30min除去活性碳。

⑤用30%~50%饱和硫酸铵盐析1次,去上清液,沉淀物用少量PBS溶解,过G-25层析柱去除硫酸铵即得RB200标记的抗体。

⑥RB200的最大吸收光谱为570。用分光光度计分别测定570nm(RB200)和280nm(蛋白)的读数,根据Wells表算出F/P克分子比值。

⑦效价高的标记抗体加0.1% NaN3或硫柳汞(0.1%)数滴防腐,分装放置20℃以下可长期保存,4℃~10能保存半年左右。

3.染色步骤染色前进行对照试验、吸收试验和抑制试验,测定抗体的纯度和特异性,同时以琼脂扩散和染色效果确定工作效价。在连续切片中,用RB200标记的IgG稀释液分别与FITC标记的IgA和IgM混合(根据染色效价,分别以对方为稀释液)进行染色。在37℃温盒内孵育45min,PBS清洗,过一次蒸馏水后风干,50%缓冲甘油封片,在冰箱中可保存10天左右。

4.阳性结果观察及细胞计数用Olympus荧光显微镜观察。选择BG12激发滤板和0515抑制滤板可同时观察两种荧光。胞浆丰富、明显绿色荧光、核不着色的细胞为IgA或IgM产生细胞;胞浆红色荧光者为IgG产生细胞。少数胞浆黄色荧光的细胞核呈圆形,位于细胞中央,可能这些B淋巴母细胞能产生两种抗体,也可能是具有共同的轻链而引起的交叉反应。如果用α、β、γ、μ、δ等重链单抗进行研究,可以进行鉴别。在荧光显微镜下数出组织切片中阳性细胞总数(N),测微器放在目镜下测出组织切片所占小方格数(P)。测微器小方格边长为0.5mm,根据物镜放大倍数(4倍)用公式D=64N/P计算出每平方毫米组织切片中所含细胞数。

三、临床意义

抗体产生细胞主要分布在粘膜固有层。IgA产生细胞多沿上皮层分布,IgG和IgM产生细胞分布全固有层。小肠粘膜含抗体产生细胞增多,胃和结肠其次,食管最少。小肠粘膜中IgA、IgM、IgG产生细胞比例为81.9:15.7:2.5,IgA产生细胞最多,IgG产生细胞最少。结肠粘膜中抗体产生细胞分布与小肠相似,但IgM和IgG产生细胞数增加。对于胃粘膜各家报道不一。多数认为IgA产生细胞最多,IgG产生细胞其次,IgM产生细胞最少,胃体和胃窦无显着差异。我们的结果与国外报道一致。正常胃肠粘膜中IgD产生细胞极少,IgE产生细胞仅占2%,胃粘膜中多于结肠粘膜。这些抗体产生细胞分泌的抗体在粘膜局部免疫起着极其重要的作用。某些消化道疾病与抗体产生细胞数量、分布和比例的异常密切相关。

1.抗体产生细胞与胃部疾病70年代国外就重视慢性胃炎胃溃疡组织中抗体产生细胞研究。多数报道认为表浅性胃炎以IgA和IgM产生细胞增加为主,轻度萎缩性胃炎以IgA产生细胞增多,可能与细菌或病毒等感染有关。中度以上萎缩性胃炎和恶性贫血病人胃粘膜中IgG产生细胞显著增加。部分病人有壁细胞、胃泌素细胞、内因子或胃组织其它成分的自身抗体。IgG产生细胞增加可能与特异性免疫反应有关。有人将壁细胞抗体阳性病人胃粘膜中分离出IgG与壁细胞共同培养,能直接破坏壁细胞。我们的结果还发现,中度以工萎缩性胃炎患者胃粘膜中T淋巴细胞和IgG产生细胞均增加,提示胃粘膜的萎缩不能排除抗体依赖的细胞毒(ADCC)作用的结果。部位原发性变异性低丙种球蛋白血症患者整个胃粘膜萎缩,粘膜中缺乏抗体产生细胞。对于胃溃疡,有人认为IgA、IgM和IgG产生细胞均增加,它们之间的比例是相对正常的,但IgE产生细胞明显增加(是正常人的10倍)。用放射免疫法测定也发现胃溃疡病人血清和胃液中IgE浓度也增高。推测IgE作用于肥大细胞后释放组织胺类物质在溃疡的病因中起重要作用。

2.抗体产生细胞与胃肠道恶性肿瘤1977年日本奥田晃三首次用免疫荧光法对89例进展期胃癌的抗体产生细胞进行测定,发现IgA、IgG和IgM产生细胞均明显减少,且与胃癌的分型和组织分类无关。我们对48例胃癌组织用双标记免疫荧光研究发现癌组织中IgA产生细胞显著减少,但IgG产生细胞显著增加,并有聚集现象;癌旁组织中抗体产生细胞增加更显著,其中IgG产生细胞增加6.2倍,肠型胃癌中IgG产生细胞显著多于胃型胃癌,肿块越大则IgG产生细胞越少。Jonder证实人类肿瘤细胞膜上有IgG的FC受体。有人将小白鼠肿瘤组织中的IgG提取证实为IgG2,在细胞培养中对癌细胞有杀伤作用。提示IgG产生细胞与抗胃癌免疫反应密切相关。我们还发现胃癌组织中IgA产生细胞只占28.5%,癌旁占40.2%,显著低于正常(55.1%)。IgA产生细胞减少可导致SIgA合成减少,引起粘膜免疫屏障功能失调。也有人认为肿瘤细胞产生某种抑制因子阻碍IgA产生细胞进入癌组织内。其确切机理仍在深入研究中。近年来,对肠癌组织中抗体产生细胞研究也有报道。发现癌组织中IgA产生细胞也显著减少,癌旁组织中IgG产生细胞增加13倍。认为与结肠癌特异性抗原或IgG的细胞毒作用密切相关。今后的研究在于从组织中分离出抗体的特异性部分在体外或体内直接作用于肿瘤细胞,筛选出能破坏癌细胞的抗体及其基因组,用分子生物学技术扩增,用于肿瘤的治疗。

3.抗体产生细胞与炎症性肠病慢性溃疡性结肠炎(CUC)和克隆氏病是病因未明的肠道感染性疾病。近年来有人发现炎症性肠病与肠道局部免疫反应有关。Golzayd等发现9例CUC肠粘膜中6例有大量IgA产生细胞浸润,认为可能与细菌或病毒感染有关。也有人发现以IgG产生细胞或IgE产生细胞浸润为主。Persson等报道克隆氏病的回盲部IgA产生细胞减少,IgG和IgM产生细胞增加,有人发现感染严重部位IgG产生细胞增加,粘膜完整部位IgM产生细胞最多。因此有人提出IgG和IgM能调节 局部T淋巴细胞免疫反应造成粘膜损伤,溃疡是IgE调节 的组织胺类物质释放过多和继发感染引起。也有人提出炎症性肠病虽然肠粘膜中抗体产生细胞增加,但细胞比例没有改变。因此炎症性肠病与体液免疫反应的关系仍需要进一步深入研究。

4.抗体产生细胞与慢性腹泻慢性腹泻是消化道常见病,粘膜免疫功能缺陷是重要原因之一。目前认为,不论体液免疫和细胞免疫缺陷,均可引起腹泻同时伴有肠道鞭毛虫、念球菌和霉菌等继发感染,这些病人胃肠道粘膜缺乏抗体产生细胞。虽然部分病人仍有IgGT和IgM产生细胞分布,但IgA产生细胞显著减少或缺如。可见IgA产生细胞在胃肠粘膜中起重要保护作用。也有人发现病人胃肠粘膜有不典型抗体产生细胞,产生的抗体很少,可能与缺乏辅助性T淋巴细胞有关。对这类病人除给予必要的抗菌素控制继发感染外,定期补充免疫球蛋白制剂或适当使用左旋咪唑和转移因子等T淋巴细胞激活剂可能使症状得到缓解。已经有人从乳汁中提取分泌性IgA治疗顽固性小儿腹泻获得成功。α-重链病患者小肠粘膜固有层大量抗体产生细胞浸润,分泌α-重链,引起肠粘膜萎缩,也能导致吸收不良和腹泻等症状。

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