第一节 胃肠道粘膜免疫细胞化学特点

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胃肠道与外界相通,其粘膜表面附着各种细菌和病毒。粘膜含有各种组织溶解酶,而且胃粘膜呈酸性,肠粘膜偏碱性,因此在进行免疫细胞化学染色过程中,必须注意以下几个环节 :

一、抗原的稳定性

免疫细胞化学和组织化学就是检查、鉴定、定位和示踪组织中各种抗原成分。在组织加工过程中,必须保持抗原的形态、结构、抗原性和在组织中的位置保持不变,不引起组织产生自发荧光及其它非特异性着色。原则上越新鲜的组织越适于进行免疫细胞化学和免疫组织化学研究。

1.组织切片标本经胃镜、小肠镜和大肠镜等内窥镜取材可以在直视下根据研究的内容在不同部位进行取材,即准确又方便。一般组织块直径多在0.5~1.0mm左右,适合进行各种抗原的研究。

(1)取材方法:将取材部位调整到内窥镜视野中央,使活检钳与粘膜面垂直,然后钳取。活检钳应尽量下压深取达粘膜全层。取出活检钳并打开活检器时要轻,防止粘膜撕裂。立即将活检组织轻轻在粘在滤纸上,并尽量使粘膜面与滤纸平行。

(2)组织固定:根据所查抗原的种类采取相应的固定方法。我们的体会是:对某些蛋白类抗原,如免疫球蛋白、SC、CEA等一般用95%冷酒精固定较好。95%乙醇不但能固定蛋白抗原,而且保持与抗体的免疫反应能力,同样可以进行HE染色。除组织有部分收缩外,组织成分和抗原位置没有大的改变,组织块可以在冰箱内长期保存。我们对保存26个月的冷酒精固定组织进行CEA和SC的研究,效果仍很好。对多肽类激素的研究可以用4%多聚甲醛缓冲淮,Bouin 缓冲液或福尔马林缓冲液进行固定,或直接液氮固定后冷冻切片。冷酒精固定的组织不宜进行多肽类激素的研究。对陈旧性福尔马林的固定的组织可以在抗原表面形成蛋白衣,直接影响抗原抗体反应。有人用胰酶消化后暴露抗原部位,进行胃泌素细胞的免疫细胞化学染色,也获得较好结果。要进行胃肠道多肽类神经的免疫组化研究,可用含Triton的固定液和冰冻切片。对小白鼠等动物可向血管内注射多聚甲醛等固定剂,然后处死取材。进行细胞膜抗原的单克隆抗体研究时最好用Cryostat冰冻切片,然后丙酮或乙醇固定10min左右。

(3)组织加工:温度对抗原抗体均有影响。一般在4进行脱水和透明。包埋选用低熔点蜡(52℃~56℃),浸蜡时间以20min左右为宜(因组织块较小)。脱蜡和脱二甲苯也应在低温下进行。

(4)组织保存及切片:石蜡包埋或其它方法加工后最好立即进行切片和免疫细胞化学染色。根据不同的抗原也可以在低温下保存一段时间后再染色。组织切片的免疫细胞化学染色实际上使切面的抗原暴露后直接与抗体相结合,一般组织切片厚度以5~7μm为宜。如果观察神经纤维则以10~20μm为好。太厚则透射光不易通过,影响观察,易出现自发荧光。如果进行免疫电镜观察,最好超薄切片。

2.涂片或印片标本拉网和内窥镜下获得的胃肠道分泌物等可直接涂片,空气干燥,再用乙醇固定后进行免疫细胞化学染色。涂片和印片缺乏明确的组织结构,标本中常常混有不同形态的组织细胞和其它蛋白等无定形成份,很容易造成假阳性,观察时应当特别注意。

3.组织分离细胞将手术或活检组织块用机械研磨或胶原酶消化等方面可分离出细胞,加入培养基,在试管内进行活细胞免疫荧光或免疫酶等免疫细胞化学染色。流式细胞仪进行定量和定性分析。此法对细胞膜抗原的研究有较大价值。我们在试管内用免疫荧光技术对周围血分离的单核样细胞进行T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞的研究中,发现OKT3、OKT4、OKT8和Ia的荧光均分布于细胞膜,随着细胞的滚动,犹如火球,非常清晰。

二、抗体的特异性

示踪抗原的抗体必须具有高度特异性,尽量减少非特异性染色和干扰。因此染色前必须测定抗体的工作效价,并用严格的阳性对照。组织切片应当有连续切片的HE染色作对照。

三、染色技术的选择性

应当根据设备条件,具备的抗体和示踪抗原的特点进行选择。我们的经验是:因胞浆性抗原含量较多,可以用简便和廉价的间接法甚至直接法免疫细胞化学染色;对膜抗原及其它一些微量抗原应当选用PAP或ABC法,如果同时进行两种以上抗原的检查,最好进行双标记和多标记免疫细胞化学染色;为了显示较弱的抗原,可以用对比染色技术,背景为另一种颜色,使阳性抗原着色更突出。

四、结果的可比性

1.如研究胃粘膜中抗体产生细胞应当掌握在HE染色时的车轮状核位于胞浆一侧,胞浆特别丰富,染色时仅胞浆着色而核不着色等特点。同时应了解所研究的抗原在组织中的大致定位及分布规律。如分泌5-羟色胺的内分泌细胞多位于固有层间质内,VIP和SP分布在固有层神经末梢及粘膜下层的神经元,胃泌素细胞分布胃肠腺体细胞之间。CEA多分布在腺癌细胞,如果在固有层内出现阳性细胞,要谨慎对待,必须排除污染、内源酶或自发荧光,同时与连续切片的HE染色切片对比观察才能作出判断。

2.阳性结果的定量分析免疫细胞化学和免疫组织化学染色受到的影响因素较多,最好在相同组织加工方面、统一批号抗血清和标记抗体、统一染色技术和结果判定方法,同时对病态和正常组织进行对照观察才能增加可比性。用免疫组织化学进行抗原定量分析时,可根据着色程度,选用某一基点为标准进行半定量计数,但容易受主观因素的影响。近年来,数字减影技术的应用,大大提高了定量研究的准确性。对阳性细胞的计数,多采取以下几种方法:

(1)直接计数法:以10~20个随意选择的高倍视野直接进行阳性细胞计数,或计算100~200个总细胞中阳性细胞的数量。由于阳性细胞分布的不均匀性,可能存在一定误差。

(2)体积计数法:测定单位面积内的细胞数,再算出每立方毫米体积内阳性细胞总数。一般组织切片只有5~7μm厚,与1mm厚度组织切片的细胞密度不可能完全一致。

(3)细胞密度计数法:即计算单位粘膜面积的阳性细胞数。有人提出以0.5mm宽,粘膜切面会层(约0.6mm)作为一个单位。因内窥镜取材时,组织块不规则,显微镜下要具体选择有一定困难,。我们用改良的Dellesses公式进行计算比较方便。原公式NV=N(P∑r2)×109,NV代表每立方毫米体积细胞数;N代表细胞总数,r为测微器小方格边长(μm);∑为切片厚度(μm);P为小方格数。我们只计算每平方毫米面积细胞数,即D=N/(P∑r2)(r单位为mm)。方和边长为0.5mm的测微器放在目镜下,物镜放大4倍,即用测微器去量放大4倍的物体,测出的边长必须缩小4倍才是物体的真正面积,已知r为0.5mm,将上述数据代入公式,得D=N(r/4)2=16N/(Pr2)=16N/(P(0.5)2)=64N/P。只要计算整个组织切片的细胞数和所占小方格数,即可得出阳性细胞密度(细胞数/mm2)。组织分离细胞可通过流式细胞仪进行计数。

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