第三节 消化道分泌生IgA

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胃肠道产生的分泌性IgA(SIgA)在其粘膜表面形成重要的免疫保护层能防止抗原性物质进入粘膜,对局部炎症和肿瘤的发生发展起重要作用,也是近年来研究局部粘膜免疫反应的重要课题。

一、S IgA合成及其功能

人体内主要含有两种形式IgA。一种为s IgA单体,主要存在血清中,多来自脾脏、骨髓和肠系膜淋巴细胞的浆细胞。另一种是与分泌成分(secretory component, SC)结合的二聚体,即SIgA,沉降系数为11S,主要存在唾液、初乳及胃肠道等分泌液中。成人肠道每天能分泌3gSIgA。目前多认为胃肠道是s IgA的中枢器官。SIgA由SC、J链和二个IgA单体组成,形成过程包括:SC的合成、J链和IgA合成、IgA与SC结合和SIgA分泌。SC是分子量为83000dalton左右的糖蛋白,由549~558个氨基酸和20%糖组成,其转录基因在上皮细胞的第1对染色体上。我们用免疫细胞化学染色证实SC主要分布在分泌性腺上皮细胞基底侧膜及游离腔面的胞浆内。杯状细胞含SC很少。SC作为免疫球蛋白的受体在SIgA的合成中起重要作用。目前已经证实SC与胃肠道固有层IgA产生细胞分泌的二聚体和J链形成二硫键。虽然40%IgG和IgD产生细胞也含有J链,但很快被溶解,故SC不能与IgG与IgD相结合。SC能与IgM五聚体结合,但结构不稳定,易被消化酶破坏。SC与IgA结合及SIgA分泌过程是近年来研究的重点课题。SC作为特异性受体位于上皮细胞膜上,其膜外部分(最外层100个氨基酸残基,即SC1)非共价键与J链和IgA的α链可变区(Cα3)结合,SC紧靠细胞膜部分(SC5)与IgA二聚体的另一条链α链(Cα2)形成二硫键。结合的SIgA通过细胞吞饮作用(pinocytosis)进入胞浆,在上皮细胞腔面释放,近年的研究表明,小白鼠的肝细胞和人胆管上皮细胞也能合成SC。人胆汁中含有IgA单体多来自血液,少部分来自门脉区及胆管内皮细胞下浆细胞。有趣的是有人发现慢性肝硬化患者周围血B淋巴细胞也能产生IgA二聚体,其机理还不清楚。

SIgA分布在粘膜表面,能封闭细菌和病毒等抗原表面及其受体结合部位或与之凝集成团状,阻止病毒和细菌和粘附。SIgA与相应抗原结合还可激活补体的替代途径,造成抗原溶解,近年来也有人发出IgA也能通过ADCC发挥细胞毒作用。有人发现先天性缺乏SIgA的病人恶性肿瘤的发病率比正常人高20~50倍。小肠之所以很少发生恶性肿瘤,粘膜中含85%以上的IgA产生细胞是重要因素之一。因此,深入研究SIgA与消化道炎症,感染和肿瘤发生发展的关系有临床实用价值。

二、对比免疫荧光染色

1.染色特点

(1)要进行SC和IgA组织定位,必须有相应特异抗血清。SC抗血清国内没有生产。国内商品IgA抗血清的抗原多来自人乳中的SIgA,具有双重抗原性(SC和IgA),不能特异进行IgA组织定位,最好采用抗人α-重链抗血清。

(2)SC是糖蛋白,IgA是免疫球蛋白。在组织处理上虽然有人提出用冷冻切片或福尔马林固定胰酶消化的方法,我们的体会用冷酒精直接固定法既简单又方便。

(3)SC和IgA除一部分在细胞内,也可以分布于间质和粘膜表面。为了提高特异性,除了染色前用琼脂扩散、对照试验、吸收试验和抑制试验等方法检验抗体的特异性和敏感性外,可采用伊文氏蓝作对比染色。伊文氏蓝肉眼下是蓝色,在荧光镜下是红色,混合染色后能衬托FITC的绿色荧光,同时抑制非特异性荧光,不影响抗原抗体结合。如果特异性染色后再加伊文氏蓝,比较费时间,效果不一定最佳。先用伊文氏蓝染组织切片,再进行特异性抗体染色能抑制抗原抗体结合,不宜使用。

2.染色步骤

(1)组织加工、固定及切片与抗体产生细胞研究(不需PBS浸洗)相同。先做HE染色,选纵向连续切片,脱蜡后在4℃PBS中浸洗3~5min,过一次蒸馏水后风干待染。

(2)用伊文氏蓝PBS稀释FITC标记的SC和IgA抗体,加在连续组织切片上,放入湿盒,37℃温箱放置45min。

(3)取出切片,用BPS浸洗3次,每次5~10min。

(4)过一次蒸馏水后风干,50%甘油封片,荧光显微镜观察。

3.结果判断和分析荧光镜下组织切片底色为红色荧光,SC和IgA呈绿色荧光。IgA和SC主要分布在分泌性腺体腔面、上皮细胞侧膜及基底部,IgA还分布在间质及固有层IgA产生细胞浆内。可根据荧光强度进行SC和IgA半定量分析,也可以用荧光光度计或数字减影技术进行准确定量。

三、临床意义

1.胃十二指肠疾病我们用免疫荧光技术对胃和十二指肠疾病研究结果与Isaonacs相似,发现正常胃粘膜中胃体腺没有IgA和SC分泌,仅上皮层有少量IgA和SC荧光。胃窦腺体细胞的腔面及侧膜均有SC和IgA,间质有IgA荧光,但没有SC荧光,上皮层SC和IgA荧光较胃体强,证实SC为粘液分泌性腺体细胞所产生,在细胞侧膜与IgA结合。正常十二指肠上皮细胞层SC和lgA特别丰富。粘膜下层十二指肠体腔面也有SC和lgA分布,但较因有层腺体细胞的分泌能力低。杯状细胞缺乏分泌SC的能力。这可能与HLA-DR组织相关抗原有关。上皮层的SIgA可能是分泌后的功能定位。正常胃体能分泌盐酸和胃蛋白酶,细菌或病毒感染机会少。胃窦特别是十二指肠粘膜多偏碱性环境,细菌和病毒等停留机会较多,SIgA增多可代偿性增加粘膜免疫保护功能。

慢性浅表性胃炎时,腺体和上皮层SC及IgA荧光明显增强。HE染色发现部分胃体腺转化成粘液分泌性腺体(固有腺或幽门腺)即具备分泌SC和结合IgA的能力。间质出现较多IgA产生细胞。这些病人可能正常粘膜屏障功能被破坏以SIgA免疫屏障功能代偿。

萎缩性胃炎中,正常腺体分泌SC功能增强,但肠上皮化生腺体及不典型增生腺体的SC荧光明显减弱。从免疫学角度支持肠上皮化生与胃癌的发生有较密切关系。

胃癌的发生和发展与SC和IgA的关系日益受到重视。在我们的研究中,发现部分癌细胞能分泌SC,与肿瘤的分化程度和组织分类无明显关系。临床上可以用SC鉴别其它部位转移肿瘤是否来自胃肠道,但也有人持不同的看法。肿瘤组织中IgA来源及s IgA在癌组织中的功能尚待进一步研究。

2.肠道疾病溃疡性结肠炎上皮细胞具有分泌SC的功能,但固有层IgA2产生细胞和J链的合成明显减少,IgA1产生细胞增加。IgA2能对抗IgA溶解酶的在破坏,有较强的免疫保护功能。故虽然SIgA的总量没有降低,但其免疫保护功能明显减弱,导致细菌或病毒感染,引起糜烂和溃疡。也有人发现炎症性反应性不典型增生的腺体分泌SC能力明显增强,具有癌变前期的不典型增生腺体明显减弱,而且随不典型增生程度加重,分泌SC和结合IgA能力减弱越明显,说明SC的免疫组织化学染色对鉴别良恶性不典型增生有一定价值。有人认为吸烟可能抑制SIgA合成,降低结肠粘膜免疫屏障功能,引起结肠癌。多数的报道认为结肠癌细胞分泌SC能力与肿瘤分化程度有关。分化程度越低,分泌SC的功能越差。双倍染色体癌细胞分泌SC的能力明显高于多倍体癌细胞。但SC与肿瘤之间的关系及其机理都在研究中。

3.其它疾病选择性免疫球蛋白A缺乏症患者虽然肠粘膜中IgA产生细胞显著增加(90%),因缺乏SIgA,不能中和和或制止过敏原的吸收,易发生哮喘食物过敏;抗原抗体复合物进入体内易诱发红斑狼疮、类风湿性关节 炎和甲状腺炎等;易引起乳糜泻及梨形鞭毛虫感染;致癌病毒或致癌物质吸收增加。有人报道9例缺乏IgA患者5例发生消化道肿瘤。爱滋病患者是HIV感染所致。有人报道病人小肠末端IgA产生细胞减少和IgM产生细胞增加,明显IgA缺乏,但在直肠没有明显改变。最近曾报道SC缺乏的患者发生肠道白色念珠菌感染。这种患者血清IgA含量正常,粘膜固有层IgA产生细胞数量不减少,但肠分泌物中SIgA缺乏。可能这些IgA产生细胞不分泌IgA或上皮细胞的SC合成障碍。

SIgA是胃肠道粘膜第一道免疫屏障,影响因素较多。上皮细胞感染和维生素A缺乏可引起继发性SC合成减少和SIgA转化障碍。营养不良可选择性减少IgA产生细胞数量。吸烟、双苯丙酰脲等药物、精神郁抑和剧烈运动均可能影响IgA合成。因此s IgA与疾病的内在联系及其机理还需进一步深入研究。

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