第九节 其它链扩增技术及应用范围

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一、免疫PCR

所谓免疫(Immune PCR)就是利用抗体与DNA特异结合来检测抗原,把抗原抗体反应与PCR联合应用而建立的一种抗原检测系统。

在免疫PCR中,一个中介分子同时具有与DNA、抗体分子特异结合的能力。其一端连接DNA(标记物),另一端连接抗原-抗体复合物,形成一个特殊的抗原-抗体-DNA连接物。作为标记物的DNA分子可用PCR的扩增,存在特异的PCR产物应证明作为标记物的DNA分子已特异地与抗原-抗体复合物结合,而且表明了抗原的存在。有人采用SAP(streptavidin – protein A)嵌合体作为中介物。它具有双特异性结合能力,一端为链霉亲和素,可结合生物素;另一端为可与IgG的Fc段结合的蛋白A。这样可特异地把生物素化的DNA分子和抗原-抗体复合物连接在一起。

选用BSA作抗原进行免疫PCR实验,结果表明,可检测出580个抗原分子(9.6×10-22mol/L),而且可以完全避免其它非特异信号的干扰。与采用碱性磷酸酶的ELISA相比,其灵敏度可提高105倍,较常规的放名分析灵敏度也高出几个数量级。

免疫PCR产物在普通的琼脂糖电泳上就可以检测出来,如用更好的方法来检测PCR产物,如放射性同位素,荧光物或酶等掺入到PCR产物中,可进一步提高其灵敏度和适用性。另外,如果采用不同大小标准的DNA进行标记,在电泳时,可同时检测出多种不同的抗原分子。

PCR产物的多少与抗原结合量有关,如果用标准反应作对照,则可以对抗原的量进行估算。因此,通过改变连接物的浓度就可以改变检测系统的灵敏性。其它因素,如抗体的浓度,PCR循环周期数,PCR产物的检测方法等也同样影响系统的灵敏性。

二、转录依赖的扩增系统(Transcription-basedAmplification System , TAS)

扩增样本中的RNA,一般要先将其逆转录成cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增,能否将RNA靶序列直接扩增出来呢?Kwok等人发明了TAS来解决这一问题。结合应用葡聚糖珠寡核苷酸杂交技术可进一步提高方法的特异性和效率。其原理是:制备引物A、B,引物A与待检RNA3’端互补,并有一T7RNA多聚酶的识别结合位点。逆转录酶以A为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3’端互补,逆转录酶同时还具有RnaseH和DNA多聚酶的活性,又可利用引物B合成cDNA的第二链。RNA多聚酶以此双链cDNA为模板转录出与待检RN-一样的RNA,这些RNA又进入下轮循环。RNA多聚酶从一个模板可以转录出10~103个拷贝,因此反应中待检RNA拷贝数以10的指数方式增加,较PCR高得多。扩增产物用葡聚糖珠夹心杂交法检测:产物先与标记的探针杂交,再与包被在葡聚糖珠上的另一互补寡核苷酸(与标记探针互补的位置不同)杂交、检测。该方法同一般杂交检测技术相比,特异性要高出许多。

TAS主要特点是扩增效率极高,由于拷贝数是以10指数递增,只有6个循环,靶序列即能达到2×106个拷贝。由此而来的另一个特点是特异性很高,在一般的RNa PCR扩增中,由于逆转录酶和Taq多聚酶均无较对活性,要发生错掺,循环次数越多,错掺率越高。TAS仅需循环4~6次,将错掺率降低了4/5。用葡聚糖珠夹心杂交法,又进一步提高了特异性。目前认为TAS是扩增RNA的首选方法。

三、再生式序列复制技术(3SR)

这一反应依赖于AMV逆转录酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。当逆转录酶合成cDNA第一链后,RnaseH降解模板RNA,逆转录酶合成cDNA第二链,T7RNA多聚酶以此cDNA为模板,转录出与样本RNA序列相同的RNA。其RNA扩增过程与TAS相同。由于所使用的工具酶工作的适宜温度是37℃,所以只要在第一步变性、复性后,整个反应过程不再需要温度循环。具体方法如下:制备引物A、B,引物A有TRNA多聚酶识别、结合位点。将引物、样本加入扩增缓冲液中,65℃,1min,降温至37℃,加入人工具酶,37℃保温1h,冰浴中止反应。可用葡聚糖夹心法检测扩增产物。

这一方法有几点值得注意:(1)反应是在37℃恒温中进行的;(2)产物中有RNA,反义RNA的cDNA,RNA的拷贝数高于Cdna(90:1);(3)效率高于PCR。使拷贝数扩增到105,PCR要85min,3SR仅要15min;(4)逆转录酶也具有RnaseH活性,反应又是在37℃中进行,因此推测某些病毒,如HIV-1感染的细胞内可能存在类似3SR的病毒基因扩增机制。

四、连接酶链式反应(Ligase ChainReaction,LCR)

该技术是Landegren等人于1988年为检出序列中点突变而设计、发明的。合成一对引物A、B,它们完成覆盖了靶序列。经退火与靶序列结合后,A、B间留下一个缺口(nick),加入连接酶封闭缺品,两引物成靶序列完整的互补链。如果靶序列中有点突变,引物不能与靶序列精确结合,缺口附近核苷酸的空间结构发生变化,连接反应不能进行,变性后引物仍是两个。Lan-degren用生物素标记引物A,用32P标记引物B。用亲和素包被的琼脂糖珠与连接产物反应,检测其放射性。显然,当靶序列中存在点突变时,检测结果是阴性的。用这种方式,Landegren将人β-珠蛋白βA、βC、βS三个等位基因区别开来。Wu等人又引入PCR的原理,在连接反应后,变性、退火、再连接,少量的靶序列就被扩增出来。Barany于1991年报道了耐热连接酶-Taq连接酶的发现及其在LCR中的应用,为LCR的实用化奠定了基础。实际操作时引物为4个,A、A、 A’和B、B’,分别与靶序列的正负链互补。每次连接反应的产物又可在下一轮反应中当模板,靶序列以指数形式扩增出来。用上面提到的标记检测方法,即可检测靶序列中有无点突变。

LCR的特异性首先取决于引物与模板的特异结合,其次Taq连接酶作用的特异性,即Taq连接酶是否仅连接与靶序列完全互补的引物。实验表明Taq连接酶的非特异活性是较低的(<1%)。控制模板、酶的浓度,使反应在接近Taq酶的温度下进行,还可进一步降低非特异连接率。Barany用这一技术,将极少量(<200个分子)的βA、βC和βS区别开来。

LCR的扩增效率与PCR相当。由于有很高的信噪比,其敏感性也很高。用Taq连接酶做LCR只在两个保温点的循环(94℃、1min和65℃、4min)。产物检测也非常方便、敏感。因此可以说LCR是目前检测已知序列中有无点突变的最佳方法。

五、PCR-SSCP分析技术

近几年来,在PCR基础上完善和发展起来的多种基因变异检测方法是基因分析和检测的一次技术革命。其中日本学者创建的PCR-SSCP(Single-Strand ConformationPolymorphism anal-ysis of PCR products)格外重要。它是指单链DNA分子在变性PAGE中电泳迁移率随其构象的改变而改变的性质。单链DNA分子的构象改变即可由DNA多态性引起,又可由基因突变引起。为此,有的学者试图用PCR-SSGE(Single-Strand Gel Electrophoresisof PCR products)代替原命名。

PCR-SSCP分析包括PCR扩增和单链产物电泳两个阶段。对于分析小于400bp的PCR产物十分有效,对于大于400bp的PCR产物需处理后再分析,必须注意的是PCR-SSCP分析不能确定基因变异部位和内容,泳动后必须进一步完成DNA测序。

六、结语

PCR技术以惊人的速度在研究与诊断领域得到应用,限于篇幅所限,在此不一一进行讨论了。本章 重点讨论了PCR技术发展的有关内容,尤为影响PCR的主要因素和PCR的各种反应模式及新进展,以求大家在实际工作中能够注意到这些问题,并有所创新,相信由于PCR自身高敏感性及实用性,在分子生物学研究与医学实践中PCR技术将越来越受到人们的重视。无论从哪一个角度,PCR技术从分子水平对许多传染病、遗传性疾病和肿瘤进行诊断,使法医鉴定、生物进化的研究更为简便和强化,在遗传学、分子生物学、生物工程与医学研究中都占有重要的地位。

PCR技术是以生物体内DNA复制为基础理论的,这一技术把基础理论与应用有机结合起来,给我们以辩证的思考。对于其它学科中有关理论与实践结合的问题具有指导意义。PCR技术必将为我们提供大量有关核酸的知识,丰富我们的理论,改变我们以前的认识,推动学科的向前发展。

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