第六节 样品处理与注意事项

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一、样品处理

DNA是染色体的主要组成部分,是PCR的扩增模板。要进行PCR,研究DNA结构与功能或者用于诊断目的,首先必须从生物体内提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在,其分子量大(人的染色体DNA平均大小为3.0×109bp),提取DNA应尽量保持DNA完整性和纯度,即在提取中尽量避免机械张力引起的DNA分子降解,又要注意杂质及蛋白的去除,防止胞内酶解DNA。因此,提取DNA的基本过程是:用Proteinase K及SDS,在EDTA存在下,裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚及胞内DNA酶失活,然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白质,在DNA中若混有少量RNA,可用RNase去除,最后用乙醇沉淀得到DNA。

理论上PCR对模板DNA纯度及完整性要求并不高,细胞经过热变性使DNA释出就可以作为模板,依赖引物的选择性进行扩增。这对拷贝数很多的基因组,确实如此。但当待扩增的拷贝数甚少而无关细胞甚多时则扩增就不易成功,其原因是:①非希望的扩增增多,掩盖了所需扩增的片段,使其数量减少至不能检测到的程度。②生物样品中的杂质会抑制PCR反应,最主要的是血液和琼脂糖。例如在100μl反应液中加入1μl全血就可引起抑制,0.8μmol/L的血红素也会引起明显的抑制。对于含血液的样品,可以用渗透压溶解红细胞,离心集取细胞核,洗除血红蛋白,再用蛋白酶/表面活性剂处理的方法来解决。另一简单的方法是煮沸之,使释放DNA,并沉淀Hb,用上清液作PCR。

现将PCR前处理各种标本的基本方法介绍如下:

1.所需溶液

(1)PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4pH7.0

(2)含表面活性剂及蛋白酶K的PCR缓冲液

50mmol/LKCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

0.1mg/ml明胶,0.45%NP40,0.45%吐温20

高压灭菌,冷冻储存。临用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(水溶液)至100μl溶液中。

(3)溶血缓冲液

0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-HCl pH7.5

5mmol/LMgCl2,1% Triton X-100

2.提取方法

(1)用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法从血液或培养细胞分离的单核细胞(当PBC〈10%细胞数时用此程序)

①将细胞样品用PBS稀释至10ml,置15ml锥形离心管中;

②100×g离心2~5min,吸去上清;

③细胞再悬浮于10ml PBS中重新离心洗涤;

④沉淀物悬浮于溶液2中,使细胞浓度约为6×106/ml,移至1.5ml管中;

⑤50~60℃保温1h;

⑥95℃保温10min使蛋白酶变性;

⑦冷冻储存。

如果RBC多于细胞的10%,则用PBS洗1次(步骤1,2)后,悬浮于1ml溶液3,并转移至1.5ml离心管中,如程序B-2离心1次,再悬浮于溶液2中按程序A-4继续进行。

(2)全血:此法使胞膜溶解故胞浆DNA丢失,约可得20μg DNA/0.5ml血。

①0.5ml全血与0.5ml溶液3共置1.5ml管中;

②13000×g离心20s;

③吸去上清,加1ml溶液3,旋涡混合使沉淀重新悬浮;

④重复第2,3步2次;

⑤13000×g离心2s,吸去上清,悬浮于0.5ml溶液2中;

⑥按程序A5~7步进行。

(3)拭子

①用PBS预温的试子从宫颈、阴道或阴茎采样;

②拭子置入2ml PBS(含抗霉剂)于15ml离心管中,室温可保存24h,置4℃可保存更长时间。也可用旋涡混合器振荡使细胞加速游离;

③取去拭子,2000~13000×g离心5min,吸去上清;

④如含RBC则加1ml溶液3,转移至1.5ml E管中,按程序B-2开始进行;

⑤如不含RBC则加溶液2,按程序A-4进行。

(4)头发

①拔下头发,剪下头发近端0.5cm段;

②置入0.4ml溶液2中(1.5ml管);

③按程序A5~7步进行,用50μl体系作PCR。

(5)血细胞RNA用焦碳酸二乙酯(DEP)抑制RNase,NP-40溶胞但不溶核。

①用聚蔗糖-泛影葡胺或其它方法分离单核细胞;

②置2ml离心管中,加PBS至细胞中,500×g离心5min;

③配制(DEP)溶液用无水乙醇将DEP作9+1稀释,再用NP-400.5%作1:999稀释(抑制RNase);

④细胞沉淀中加200~400μl此溶液,旋涡混合;

⑤13000×g离心10s;

⑥上清转移至新管中,37℃保温20min,90℃,10min;

⑦离心,上清转移至新管。取5~10μl作反转录;

⑧如果反转录失败,可能因DEP残留,可将样品再在90℃加热5min,再做试验;

⑨本法也可用于培养细胞。

二、注意事项

PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增,应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染,这是造成假阳性最大的可能。下例可形象说明污染的严重性。

典型的PCR反应可在100μl反应液中扩增1012个DNA,此液倾入50nm×25m×2m的游泳池中,充分混合取0.1ml池水,其中含有40个分子的DNA,用PCR扩增即已可呈阳性,这一点对检测HIV更为重要。常规只要15个拷贝的核酸即可查出。假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染,尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下,更有必要采取防备措施。

(1)DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理,常规消耗用品用后作一次性处理,避免反复使用造成污染。

(2)PCR在超净台内进行,操作前后紫外灯消毒。

超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品;移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。

(3)PCR操作应戴手套并勤于更换。

(4)成套试剂,小量分装,专一保存,防止它用。配制试剂用新器具,用后作一次性处理。

(5)试剂管用前先瞬时离心(10s),使液体沉于管底,减少污染手套与加样器机会。

(6)最后加模板DNA(包括在石蜡油后),马上盖好,混匀,瞬时离心(10s),使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染,所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。

(7)实验设阳性、阴性对照。

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