第八节 PCR临床应用领域及特点

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一、PCR应用特点

1.操作简便目前PCR技术采用耐高温Taq DNA聚合酶,并且在有电脑控制的DNA扩增仪中进行,使操作大为简化,一次加入的酶即可满足反应全过程。DNA扩增仪能自动迅速升降温度,只需把反应所需的全部材料混匀,置入仪器内,反应便依所输入的程序进行。

2.省时应用TaqDNA聚合酶时,单核苷酸掺入速率较高,75~80℃时,每个酶分子每秒钟可完成150个核苷酸的合成。PCR每一周期需数分钟,所以,一般常取用20~30个周期能使目的DNA达数到百万倍扩增的反应只要数小时即可完成。在基因分离、突变体构建、DNA测序等方面,PCR方法均较之常规法快速的多。例如,用常规方法建立cDNA库或染色体DNA库来分离基因,需花几个月,用PCR方法只需1~2个月星期;用M13法构建突变体需1~2个月,而PCR法只用数天;PCR方法扩增的目的DNA片段可直接用作序列分析,较常用的通过克隆、培养扩增、纯化制备等步骤获得测序片段更为简便。

3.灵敏度高PCR产物的生成是以指数方式增加的,所以欲扩增pg量级的起始物到μg水平或放大真核细胞单拷贝基因,通过PCR方法都是不难完成的。PCR方法可用单、双倍体细胞、一根头发、甚至单一精子进行DNA定型。

4.特异性强作为引物的寡核苷酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键。Taq DNA聚合酶耐高温的性质使反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的目的片段也能保持很高的正确程度。

5.对原始材料质量要求低由于PCR技术有较高的灵敏度和特异性,故仅含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者总RNA,就可以用做反应起始材料来获取目的产物。部分降解的DNA材料也可以通过PCR多次反应周期,最终得到所需的全长DNA片段。

6.有一定程度的单核苷酸错误掺入由于Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’核酸外切酶活性,因而不能纠正反应中发生的错误的核苷酸掺入,标准条件下,其错误掺入率可达1.25×10-4~1×10-5。但是,这种错误并不意味着PCR产物一定会发生序列改变。Innis MA发现,错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向,这就使得发生了的错误不会再扩大。

二、PCR应用领域

单克隆抗体技术曾使免疫学理论与实践有了新的突破,近几年来PCR技术使分子生物学及相关学科发生了一次方法学的革命。在不到10年的时间内,在以下几个领域中PCR技术已具有实用价值,且其应用范围正在不断扩大中。

1.遗传病的产前诊断 用胎儿羊膜细胞,羊水或甚至母血可以检查胎儿的性别,这在与性染色体关联遗传病诊断中是必要的。对于高发的遗传病,如地中海贫血、镰刀状细胞贫血、凝血因子缺乏、DMD等已在临床应用多年,为优生优育作了贡献,对于有遗传倾向的疾病尤其是老年性疾病,如糖尿病高血脂症、甚至肿瘤中的一部分,均是当前研究的重点,近期内可望有突破。

2.致病病原体的检测 这些外源入侵的基因,一旦阐明其部分核酸序列,就可以设计引物或探针,用PCR、PT-PCR或杂交方法来检测,其范围包括细菌、病毒、原虫及寄生虫、霉菌、立克次体、衣原体和支原体等一切微生物,PCR诊断的特点是可以选择其基因中的保守区作通用检测,也可以选定差异较大的基因部位作分型检测。既可以做一病原体的专用检测,也可以将有关病毒、细菌中不同的品种作一次多元检测。而且检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法,所需时间也已达到临床要求,这对于难于培养的病毒(乙肝),细菌(如结核、厌氧菌)和原虫(如梅毒螺旋体)等来说尤为适用。

3.癌基因的检测和诊断 虽然对癌基因的研究大部分还属于基础阶段,但癌变是由基因变异所导致的这一基本事实已无庸置疑,所以癌基因、抗癌基因入抗转移基因的研究,离开分子水平的诊断手段是无法进行的,临床上已可应用的例子有白血病残留细胞的定量(包括慢粒和急粒),肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活,神经质瘤N-myc基因的激活和表达。通过原位杂交观察特定癌基因及抗转移基因的植入和反义寡核苷酸对强表达癌基因的阻断均已成为近代基因治疗的着眼点。

4.DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证 这一为公、检、法部分所瞩目的课题已经在某些国家取得法律认可。肌红蛋白小卫星基因,β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重复次数的差异都被应用于鉴定,其灵敏度已达到一根头发、一个细胞、一个精子取得个体特征图谱,这一领域也已发展到骨髓或脏器移植配型及动物种系的研究中。

5.动、植物检疫 灵敏、特异、快速诊断检测方法是我国进出口口岸的门卫,检查出入国门的人员、动、植物(种畜、种籽)等是否携带烈性传染病(艾滋、动物病毒、植物病毒等)病原体,食品、饲料等是否带沙门氏菌等均需要基因诊断手段将这些病菌拒之于国门之外,是提高我国综合国力的必要保证。

6.高科技生物医学领域中的应用 在转基因动植物中检查植入基因的存在。PCR技术尚可应用于基因拼接、测序等领

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