第一章 基因诊断与性传播疾病

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现代分子生物学无论是在理论研究还是实际应用上,都已处于生命科学的最前沿,它的发展彻底改变了我们对生物体的认识。这些发展对于研究和治疗人类的疾病,尤其是性病有着重大的意义。分子生物学使我们重新认识性病的发生和发病机理。在探讨性病的诊断和治疗以及有关预防疫苗的研制等各方面,都采用了分子生物技术和方法。利用分子生物学方法对各种性传播性疾病进行病原学诊断,是近年来的主要进展之一。它的优点是高度的特异性和极大的提高了检测的敏感性。可以检测到标本中只有一个基因拷贝的病原微生物。用分子生物学方法诊断那些培养困难的病原微生物显得更为优越。此外,还可以用来进行流行病学、发病机理及药物治疗监测的研究。现将基因诊断的分子生物学基础及在性病领域常用的有关分子生物学的基本方法和原理进行概述。

第一节 基因诊断的分子生物学基础

基因诊断操作的对象为基因或其片段。基因是遗传学上的一个概念,是在染色体上占有一定的位置,表现一定功能的基本单位。基因的物质基础是脱氧核糖核酸(DNA)(有些病毒的基因是核糖核酸,RNA)。原核细胞(如细菌和病毒)的基因单位较小,其排布一般是连续的。真核细胞的基因一般较大,其排布是不连续的,它被称为插入序列的部分所分隔。

一、DNA及RNA的化学组成

DNA和RNA统称为核酸,早在1868年就被瑞士年轻医生米歇尔发现,在真核细胞中,98%以上的DNA存在于细胞核,少量的DNA分布在线粒体中。RNA主要存在于细胞质中,占其总量的90%左右。细胞外液则无核酸存在。对于非细胞形态的病毒来说,或含有DNA,或只含有RNA,因此可按所含核酸类型的不同,将病毒分为DNA病毒与RNA病毒。

组成核酸的基本单位是单核苷酸,所以核酸又称为多核苷酸。单核苷酸是由磷酸、戊糖及碱基组成。如果戊糖是脱过氧的,则形成的单核苷酸为脱氧单核苷酸。单核苷酸相互缩合形成RNA,脱氧单核苷酸相互缩合形成DNA。下表列举常见的核苷酸及缩写符号。

表1-1 常见核苷酸及其缩写符号

碱 基核糖核苷酸(缩写)脱氧核糖核苷酸(缩写)
腺 嘌 呤腺嘌呤核苷酸(AMP)腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)
鸟 嘌 呤鸟嘌呤核苷酸(GMP)鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)
胞 嘧 啶胞嘧啶核苷酸(CMP)胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)
尿 嘧 啶尿嘧啶核苷酸(UMP)胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)

由于核酸的合成是一个耗能的过程,故参与DNA或RNA合成的脱氧或未脱氧的单核苷酸是三磷酸核苷酸,合成时磷酸键水解释放出能量,以供核酸的合成。

表1-2 三磷酸核苷酸的种类及符号

DNARNA
腺嘌呤脱氧三磷酸核苷酸(dATP)腺嘌呤三磷酸核苷酸(ATP)
鸟嘌呤脱氧三磷酸核苷酸(dGTP)鸟嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)
胞嘧啶脱氧三磷酸核苷酸(dCTP)尿嘧啶三磷酸核苷酸(UTP)
胸腺嘧啶脱氧三磷酸核苷酸(dTTP)胞嘧啶三磷酸核苷酸(CTP)

二、DNA分子结构

(一)DNA的碱基组成规律

组成DNA分子的脱氧核苷酸主要有四种,即dAMP,dGMP、dCMP和dTMP(d代表“脱氧”的意思),此外还含有少量的稀有碱基(主要是甲基化碱基)。50年代初,E.Chargaff等人对来自不同生物的DNA进行完全水解,对碱基进行了定量测定,总结出如下规律,一般称它为Chargaff规则。

1.所有DNA分子中,嘌呤碱总摩尔数等于嘧啶碱总摩尔数,即A+G=T+C,并且以摩尔为单位,A=T、G=C。

2.DNA的碱基组成具有种属的特异性,即不同生物种属的DNA具有各自独特的碱基组成。

3.DNA的碱基组成没有组织、器官的特性,即同种生物中不同组织及器官的DNA在碱基组成上是一致的。

4.生物体内DNA的碱基组成不受年龄、营养状态和环境的改变之影响。在所有DNA分子中A=T、G=C这一规律的发现,为DNA双螺旋结构模型的建立提供了重要的依据。

(二)DNA的一级结构

与蛋白质结构相似,核酸的结构也可分一级结构与空间结构进行讨论。核酸的一级结构是指其多核苷酸链中核苷酸的排列顺序。核酸的空间结构是指多核苷酸链内或链间通过氢键等折叠卷曲的构象。核酸的空间结构又有二级结构与三级结构之分。

DNA是由四种脱氧核糖核酸通过3′.5′——磷酸二酯键彼此连接而成的线形或环状大分子。DNA分子没有侧链。其骨架由脱氧核糖和磷酸组成DNA的一级结构即是DNA多核苷酸链中核苷酸的排列顺序。

由于生物遗传信息储存于DNA的核苷酸序列中,若能搞清各种生物DNA的脱氧核苷酸排列顺序,则对生命活动本质的认识将有重大意义。

(三)DNA的二级结构

目前公认的DNA二级结构是双螺旋结构,这种模型的建立,主要有两个方面的根据。一是前面提到的50年代初E.Chargaff等人对各种DNA碱基组成的定量分析结果。二是Wilkins小组用X光衍射法研究DNA的晶体,测得DNA分子呈螺旋结构。1953年j .Watson和F.Crick通过进一步研究,提出了DNA分子双螺旋结构模型。从而大大推动了分子生物学的发展。

DNA双螺旋结构模型的要点如下:

1.DNA分子由两条走向相反(一条5′→3′,另一条3′→5′)但互相平行的脱氧核糖核苷酸链组成,以一共同轴为中心,盘绕成双螺旋结构。

2.碱基在双螺旋内侧。一条链碱基上-NH的氢原子与另一条链碱基上的氧原子或氮原子形成氢键。氢键总是发生在A与T,G与C之间,前者有两个氢键,后者有三个氢键。这称为碱基配对或碱基互补规律。由此,两条多核苷酸链又可称为互补链。

3.各碱基对处于同一平面,且垂直于双螺旋的中心轴。相邻碱基对之间尚存在范德华(Vander Warls)引力,从而进一步稳定了双螺旋结构。

4.双螺旋的直径为2nm,每个螺距为3.4nm,内包含10个碱基对,因此每个碱基对距离为0.34 nm。

(四)DNA的三级结构

DNA三级结构是指双螺旋链作进一步的扭曲构象。超螺旋结构是DNA三级结构形式。目前发现许多病毒DNA,线粒体DNA,都是环型双链DNA,而具有超螺旋结构。当超螺旋型DNA的一条链上出现缺口时,超螺旋结构被松开,可解旋形成开环型结构。

DNA的三级结构与其结合的蛋白质有关。真核细胞染色质的基本结构单位是核小体。核小体是由组蛋白H2A,H2B,H3和H4各二个分子组成的八聚体,外绕DNA形成核心颗粒。连接各核心颗粒的区域称连接区,它是由组蛋白H1及大约60-100个碱基对DNA组成。一个完整的核小体由核心颗粒与连接区组成。各个核小体彼此相联沿染色质纤维的纵轴列成一种串珠状重复性结构。串珠状核小体长链可进一步卷曲,形成螺旋筒结构。在形成染色单体时,螺旋筒再进一步卷曲、折叠。人体每个细胞中长约1.7μm的DNA双螺旋链,最终被压缩8400多倍,分布于各染色单体中。

三、RNA分子结构

(一)RNA类型

细胞内含有三类主要的RNA,即核蛋白体RNA(RibosomalRNA, rRNA)、转运RNA(Transfer RNA,tRNA)及信使(Messenger RNA,mRNA)。

1.rRNA。是核蛋白体的组成部分,含量最多,约占细胞内全部RNA的74~80%,在真核细胞中有四种rRNA,分子大小不均。它们分别与70多种蛋白质相结合而构成核蛋白体大小亚基,是蛋白质生物合成的“装配机”。

2.tRNA。占细胞内RNA总量的10~25%,分散于胞液中。种类很多,每种氨基酸都有与

其相对应的一种或几种tRNA。tRNA分子由70~90个核苷酸组成,所以分子量较小,tRNA的生理功能是运输活化了的氨基酸,参与蛋白质的生物合成。

3.mRNA。占细胞内RNA总量的2~5%,其代谢活跃,更新迅速,所以半衰期较短。细胞内mRNA的种类很多,但每种mRNA的含量却很少,它是蛋白质生物合成的直接模板。

(二)RNA的碱基组成

RNA分子中所含的四种基本碱基是:腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外还有一些稀有碱基,如假尿嘧啶及带有甲基化的碱基等。RNA的碱基组成,不像DNA那样具有严格的A-T,G-C的规律。RNA结构也不像DNA那样整个分子都是双螺旋结构,而且只有局部呈双螺旋结构。

(三)RNA分子结构

除少数病毒外,RNA分子均为单链结构。与DNA相似,核苷酸通过3′.5′—磷酸二酯键连接而成多核苷酸链。单链结构的RNA,在局部区域由于自身回折也可盘曲形成双螺旋结构。双链部位的碱基一般也彼此通过氢键而互相配对,即A-U,G-C。有些不参加配对的碱基往往被排斥在双链外,形成环状突起。在不同的RNA分子中,双螺旋区所占比例也不相同。

1.tRNA结构

在所有RNA中,对tRNA的研究为最多,了解得也较清楚。tRNA的二级结构多呈三叶草形。由于双螺旋结构所占比例甚高,所以三叶草形结构十分稳定。tRNA是核蛋白体的组成部分。目前虽已测出不少的tRNA分子的一级结构,但对二级结构与其功能的研究还需进一步深入。

2.mRNA结构

mRNA分子结构的特点是,极大多数真核细胞mRNA的3′—端有一段长约200个碱基的多聚腺苷酸,称为mRNA的“尾”。这种结构可能与mRNA在细胞核内合成后移至细胞质的过程有关。在mRNA分子的5′—端接一个7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸,称它为mRNA的“帽”。mRNA分子中有编码区与非编码区。编码区是所有mRNA分子的主要结构部分,决定蛋白质分子一级结构。非编码区与蛋白质生物合成的调控有关。

3.rRNA结构

rRNA是核蛋白体的组成部分。目前虽已测出了不少的rRNA分子的一级结构,但对二级结构与其功能的研究还需进一步深入。

四、核酸的理化性质

天然DNA分子的长度可达几厘米,而分子直径只有2nm。如此细丝状的双螺旋结构使DNA分子具有一系列理化特性。如粘度极大,在外力作用下易断裂等。

(一)核酸的分子大小与粘度

天然DNA的分子量极大,例如,果蝇巨染色体只有一线形DNA,长达四厘米,分子量约为8×102道尔顿。高分子溶液的粘度比一般溶液的粘度要大得多,不规则团分子比球状分子的粘度要大,而线形分子的粘度更大。因此在溶液中呈线形分子的DNA,即使是极稀的溶液,也具有极大的粘度。RNA溶液的粘度要小得多。当核酸溶液在某些理化因素作用下发生变性,使螺旋结构转变为线团时,粘度降低。所以可用粘度作为DNA变性的指标。

(二)核酸的紫外吸收

嘌呤碱、嘧啶碱以及由它们参与组成的核苷,核苷酸及核酸对紫外光都有强烈的吸收作用。它们吸收紫外光的共同特点是在260nm处为最大吸收值。而由芳香族氨基酸参与组成的蛋白质最大吸收值在280nm处。利用这一特性,可以鉴别核酸样品作为杂质的蛋白质含量。

(三)核酸的变性、复性与杂交

1.核酸变性

核酸变性是指核酸双螺旋结构解开,氢键断裂,但并不涉及核苷酸间磷酸二酯键的断裂。若磷酸二酯键的断裂称为降解,核酸降解时,核酸分子量降低。而核酸的变性并不引起核酸分子量的变化。

引起核酸变性的因素很多。由于温度升高而引起的变性称热变性。如将DNA的稀盐溶液加热到50℃以上几分钟,双螺旋结构即破坏,氢键断裂,DNA分子的两条链彼此分离,形成无规则线团。变性后的DNA,由于结构上的变化,因而发生了一系列理化性质的改变,如260nm处紫外吸收值升高(称增色效应),粘度降低以及生物学活性丧失等。能使50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(Melting temperature,Tm)Tm一般为70~85℃。Tm值与分子中G—C含量有关,即G—C配对数愈多,则Tm值愈高,反之愈低。由于溶液酸碱度的改变而引起的变性称酸碱变性。对DNA分子来说,碱基对在pH4.0~11.0之间最为稳定,超此范围,可引起DNA分子酸碱变性。乙酸、丙酮等有机溶液及尿素也可引起核酸的变性。

2.核酸复性

变性DNA在适当条件下,又可使两条彼此分离的链重新缔合而形成双螺旋结构,这一过程称为复性或退火。复性后的DNA可基本恢复一系列的理化性质,生物学活性也可得到部分恢复。

变性核酸的复性是有条件的。如将热变性的DNA溶液骤然冷低温,DNA不可能复性。只有缓慢地将它冷却时,DNA才有可能复性。另外,变性DNA片段越大,则复性越慢。变性DNA浓度越大则越易复性。

3.核酸杂交

不同来源的DNA加热变性后,只要两条多核苷酸链的碱基有一定数量能彼此互补,就可以经退火处理复性现象,形成新的杂交体双螺旋结构,这种依据相应碱基配对而使不完全互补的两条链相互结合称为分子杂交。因此分子杂交的基础是DNA的变性与互补,也可以杂交形成新的双螺旋结构。目前杂交技术已广泛地应用于核酸结构与功能的研究。将已知的特定基因(如先天性遗传疾病的某些特定基因)用同位素标记,制备成基因探针,利用分子杂交技术,基因探针可与同源序列互补形成杂交体,因此可用检测组织细胞内有无特定基因或DNA片段,如临床上已应用于产前诊断遗传性疾病。

五、DNA的复制

DNA作为遗传物质的基本特点就是能够准确地自我复制,而DNA的互补双螺旋结构对于维持这类遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。

(一)DNA复制的方式

从前面的内容可知,DNA是由两条互补的多核苷酸链组成的,其中一条链上的核苷酸排列顺序可以决定另一条链上的核苷酸顺序。据此推测,在复制过程中,首先DNA双螺旋的两条多核苷酸链之间氢键断裂,双链解开,然后每条链各自作为模板,以脱氧核糖核苷酸为原料,按照碱基配对规律,合成新的互补链。这样形成的两个子代DNA分子与原来的亲代DNA分子的核苷酸顺序完全相同。在此过程中,每个子代分子的一条链来自亲代DNA,另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制。实验证明,DNA半保留复制的方式是正确的。由于DNA在代谢上的稳定性,经过许多代的复制,DNA分子上的遗传信息仍可传给后代。

(二)参与复制的酶类

DNA的复制过程极为复杂,但其速度甚快,这是由于许多酶参与了复制过程。

1.DNA聚合酶(DNApolymerase)。四种脱氧核糖核苷酸(dNTP,N代表A、T、G、C四种碱基)是DNA合成的原料。在原有DNA模板链存在时,DNA聚合酶催化四种dNTP通过与模板链的碱基互补规律,合成新的DNA链,故此酶又被称为DNA指导的DNA聚合酶(DNa directed DNA polymerase,缩写为DDDP)。

值得注意的是,DNA聚合酶不能自行从头合成DNA链,而必须有一个原有的多核苷酸链作为引物,DNA聚合酶只能在引物的3′末端上逐步合成DNA链。由此可见,DNA链的合成方向是从5′端至3′端进行的。

无论在原核细胞或真核细胞中,均存在着多种DNA聚合酶,它们的性质不完全相同。目前认为,在真核细胞中,DNA聚合酶α在复制中起关键作用,而DNA聚合酶β主要在DNA损伤的修复中起作用。

2. 引物酶。由于DNA聚合酶不能自行从头合成DNA链,因此在复制过程中首先需要合成一小段RNA的多核苷酸链作引物,在这段RNA引物的基础上引导DNA链的合成,催化RNA引物合成的酶是引物酶,实际上它是一种特殊的RNA聚合酶。

3.DNA连接酶。因为复制过程中,DNA链的合成方向只能由5′端→3′端方向进行,因此其中有一条新链的合成是不连续的。起初生成的是许多短链。需要DNA连接酶将它们连接起来。

4.参与DNA解旋、解链的酶及因子。已知DNA具有超螺旋结构。复制时必须松弛DNA模板的超螺旋结构,并使DNA的双链分开,暴露碱基,否则不可能在模板上按碱基配对原则合成新的互补DNA链。松驰模板DNA超螺旋,分开双链主要由拓扑异构酶,解链酶及DNA结合蛋白等来完成。

(三)DNA复制的过程

DNA复制大致可分为以下几个阶段。

1.起始与引物RNA的合成

DNA复制有固定的起始部位,在真核细胞DNA双链上有多个起始部位。复制时,解链酶等先使DNA的一段双链解开,形成复制点。这个复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉。引物酶能辩认起始部位,并以四种核糖核苷酸为底物,以解开的一段DNA链为模板,按5′-3′方向合成RNA片段。在这一阶段只合成了引物RNA,为DNA链的合成做好了准备工作。

2.DNA片段的生成

在细胞内,DNA的两条链都可作为模板,同时合成两条DNA链。由于DNA两条链是反向平行的,即一条链是5′→3′方向,而另一条链则是3′→5′方向。但是,DNA聚合酶催化DNA链的合成只能顺着5′→3′方向进行。因此,在新的DNA链中有一条连续合成的(称前导链),而另一条是不连续合成的(称随从链。在随从链合成过程中,先合成的是较短的片段(称为冈崎片段),然后将这些片段再连结起来,形成完整的DNA链。冈崎片段的合成方向仍然是5′→3′,反应直至下一个引物RNA的5′端为止。

3.RNA引物的水解

DNA片段合成一定长度后,链中的RNA引物被核酸酶水解而切掉。此时出现的缺口由DNA片段继续延长而填补。

4.完整的DNA分子的形成

相邻的两个DNA片段在DNA连接酶作用下连接起来,形成大分子DNA链,与其对应的模板DNA链一起生成子代双螺旋DNA,即完整的DNA分子。

DNA复制过程十分准确,极少发生错误,由此保证了子代DNA与亲代DNA分子完全相同,这是遗传稳定性的重要基础。某些因素可使DNA结构改变,则导致子代DNA结构的相应变化,称为遗传的变异。

第二节 核酸分子杂交法

这是最早用于性病诊断的重组DNA技术。基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。待测核酸序列为性病病原体基因组或质粒DNA。探针以放射核素或非放射性核素标记,以利于杂交信号的检测。

所谓杂交(hydridization)指两个以上的分子因具有相近的化学结构和性质而在适宜的条件下形成杂交体(hybrid),杂交体中的分子不是来自一个二聚体分子。同一个二聚体中的两个分子在变性解离后重组合称为复性。利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术,它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术,我们把标记的分子叫探针(Probe)。将探针技术与分子杂交技术相结合,从而使分子杂交技术得以广泛推广应用。目前所用的核酸杂交技术均应用了标记技术。

(一)DNA的变性

DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,称为DNA变性。加热、改变DNA溶液中的pH,或有机溶剂等理化因素的影响,均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加。

(二)DNA复性

变性DNA只要消除变性条件,二条互补链还可以重新结合,恢复原来的双螺旋结构,这一过程称为复性。复性后的DNA,理化性质都能得到恢复。

核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间,由于DNA一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH值来实现。使单链聚合成双链过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。

(三)探针——靶分子反应

从化学和生物学意义上理解,探针是一种分子,它带有供反应后检测的合适标记物,并与特异靶分子反应。抗体——抗体、外源凝集素——碳水化合物、亲合素——生物素、受体——配基(Ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针——靶分子反应,蛋白质探针(如抗体)与特异靶分子是通过混合力(疏水离子和氢键)的作用在少数特异位点上的结合,而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同,通过氢键几十、几百甚至上千个位点上的结合。这就决定它的特异性。

基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类,根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。

一、核酸探针的种类

(一)DNA探针

DNA探针是最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获的DNA探针种类很多,有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针,这类探针多为某一基因的全部或部分序列,或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的,如细菌的毒力因子基因探针和人类ALU探针,这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例,目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多,是细菌分类学的一个发展方向,加之分子杂交技术的高度敏感性,分子杂交在临床性病病原体诊断上具有广泛的前景。

DNA探针(包括cDNA探针)有三大优点:第一,这类探针多克隆在质粒载体中,可以无限繁殖,取之不尽,制备方法简便。其次,DNA探针不易降解(相对RNA而言),一般能有效抑制DNA酶活性。第三,DNA探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等,能用于同位素和非同位素标记。

(二)cDNA探针

cDNA是指互补于mRNA的DNA分子(complementary DNA)。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶的DNA聚合酶催化产生的。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后,病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA,并进而整合入宿主细胞染色体DNA分子,随宿主细胞DNA复制同时复制,这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下,可被复制多代,但不被表达,故无毒性,一旦因某种因素刺激而被活化,则该病毒大量复制。如其带有癌基因,还可能诱发细胞癌变。

逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术,广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有AMV逆转录酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物,在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cDNA链,然后再用RNaseH将mRNA消化掉,再加入大肠杆菌DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链,即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。

所得到的双链cDNA分子经S1核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头(Adapter),再经特定限制酶消化产生粘性末端,即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA,如λgt、EMBL和Charon 系列等。用这类载体可以得到包含105以上转化子文库,再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。

(三)RNA探针

RNA探针是一类很有前途的核酸探针,由于RNA是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针,这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的,标记效率往往不高,且受多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的,而不是用于检测。例如,在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因组DNA克隆时,因无DNA探针可利用,获得HIV的全套标记mRNA作为探针,成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。

随着体外逆转录技术不断完善,已成功的建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体PSP和PGEM,这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动子,在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可进行RNA转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段,则可以以DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高,在1小时内可合成近10μg的RNA产物。只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的dUTP,则所合成的RNA可得高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记分子的利用率。

RNA探针和cDNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率,但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。

(四)寡核苷酸探针

前述三种探针均是可克隆的,一般情况下,只要有克隆的探针,就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时,也常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强,复杂度也高,从统计学角度而言,较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少。克隆探针的另一优点是,可获得较强的杂交信号,因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是,较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不配的两个序列,克隆探针不能区分,往往杂交信号相当。这既是其优点,又是其缺点,优点是当用于检测病原微生物时,不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊,缺点则是不能用于检测突变点。这种情况,通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。

合成的寡核苷酸探针具有以下特点:第一,由于链短,其序列复杂度低,分子量小,所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。第二,寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化,因为短探针中碱基错配能大幅度降低杂交体的Tm值。第三,一次可大量合成寡核苷酸探针,使得这种探针价格低廉,与克隆探针一样,寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。最常用的寡核苷酸探针长18—40个硷基,目前的合成可有效地合成至少50个碱基的探针。

对于合成的寡核苷酸探针有以下要求:

(1)长度以18-50碱基为宜,较长探针杂交时间较长,合成量也低;较短探针特异性较差。

(2)碱基成分:G+C含量为40%-60%,超出此范围则会增加非特异杂交。

(3)探针分子内不应存在互补区,否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。

(4)避免单一碱基的重复出现。

(5)一旦选定某一序列符合上述标准,最好将该序列与核酸库中的核酸序列比较,探针序列应与靶序列核酸杂交,而与非靶区域的同源性不应超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源。否则,该探针不能用。

二、核酸探针的标记和检测

分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式,是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测,必须将杂交链中的一条用某种可以检测的进行标记,这条链就称为核酸探针。因此,核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高,信号强,所以最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高,但却存在辐射危害和半衰期限制(32P半衰期为14.3天,35S半衰期为87.1天,125I半衰期为60天),3H的半衰期长达12.3年,但它所释放β射线的能量太低,只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点,近年来,人们在寻找非放射性标记物方面取得了很大进展。国内已具备生物素类标记物的生产能力,并有相应试剂出售。目前非放射性标记物有下述几类:金属如Hg、荧光物质如F2TC、半抗原如地高辛、生物素、酶类如辣根过氧化物酶(HRP)、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶(AKP)等,不同的标记物,所标记探针的方法及检测方法也各异。

核酸探针的常用酶促标记技术有:缺口平移;DNA快速末端标记;用T4多核苷酸酶标记DNa5'末端,随引物延伸;聚合酶链反应。

核酸探针的非放射性标记技术有:光促生物素标记核酸、酶促生物素标记核酸、寡核苷酸的生物素末端标记、酶标DNA、酶标寡核苷酸、DNA半抗原标记。

三、核酸分子杂交方法

随着基因工程技术的发展,新的核酸分子杂交技术不断出现和完善,核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上,一条反应核酸链游离在溶液中,固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

在固相杂交中,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点,所以比较常用。常用的固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型,由于液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高,所以不如固相杂交那样普遍。近几年由于杂交检测技术的不断改进,商业性基因探针诊断盒的实际应用,推动了液相杂交技术的迅速发展,下面对固相杂交和液相杂交分别进行介绍。

(一)固相膜核酸分子杂交方法。

固相核酸杂交多是在膜上进行,因此,以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法。

1.DNA的变性解链是杂交成功的关键,Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/l NaCl和0.5mol/L NaOH中1小时,然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl (pH8.0)和1.5mol/L NaCl溶液中和1小时。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性,但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解、热变性要在低DNA浓度(100μg/ml)和低盐浓度(0.1SSC 15mmol/L NaOH,1.5mmol/L柠檬酸三钠,pH7.0)下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml,加10mol/l NaOH使最终浓度为0.1mol/L(pH约12.8),室温变性10min,很快置冰盐水中,用10mol/l HC1或5mol/L NaH2PO4调pH到7-8(亦可用碱变性后,调至中性,再加热100℃后,调至中性,或只加热100℃10min)。DNA变性可用OD260增加(约30-40%)来检测,变性DNA醇沉淀呈雪样,完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC,冰溶保存。

2.变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素滤膜(孔径0.45um)先在蒸馏水中充分浸泡,再用6SSC浸泡30min~2h,凉干,DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后,先室温干燥4h,然后再在80℃真空干燥2h。

3.预杂交。湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中,按每平方厘米膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液(6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt液,100μg/ml鲑鱼精DNA)。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理,然后酒精沉淀纯化,调浓度至10μg/ml,用前放100℃水溶液中煮沸变性10min,冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽,用封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68℃水浴中保温3-12h,当预杂交液温度升至68℃时,在滤膜表面常会形成水气泡,轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡,这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。

4.杂交。 从水浴中取出塑料袋,用剪刀剪开一角,尽可能挤净预杂交液,用吸管或大枪头将杂交液加入袋中,用恰好足量的液体保持滤膜湿润(50ul/cm2)。溶液的组成是6×SSC,0.01mol/L EDTA,变性的标记核酸探针,5×Denhardt液,0.5%SDS,100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后,将塑料袋严密封口。杂交反应在68℃水浴中进行,所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定,一般为4-20h。

5.洗膜。取出塑料袋,用剪刀剪开,小心取出滤膜,立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中,室温下漂洗5min,再将滤膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),然后将滤膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃轻轻摇动保温2h,更换缓冲液后继续保温30min。

洗脱的温度一般应控制在Tm值12℃以下,[Tm=69.3+0.41×(G+C)%],双链DNA的Tm值随错配碱基对数每增加1%而递减1℃。

6.结果显示。放射性测定方法,固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式,一是放射自显影法、另一是液闪计数法,放射自显影法比较简单,只需将杂交膜与X光片在暗盒中暴光数小时至数天,再显影,定影即可。对于杂交信号较强的固相膜,用一块增敏屏可显著增强暴光强度。此外,为了减弱32P的放射,暴光通常在-20℃或-80℃下进行。液闪计数法主要用于斑点和狭缝杂交及为了比较两个杂交信号的强弱等情形,方法是将完成杂交的膜在漂洗结束后剪成小块(每份样品1块),80℃真空干燥后装闪烁瓶,加入2—5ml闪烁液,剪2-3块无样品作为本底对照,在液体闪烁计数器上自动计数,液体计数测定放射性强度也可以在放射自显影之后进行。

(二)固相核酸分子杂交类型

1.菌落原位杂交(colony in situhybridization)。是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA,将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。

实验步骤如下:

①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上,用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上,排列成方格栅,膜和板上菌落位置相同。

②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。

③在一块平皿中置4张滤纸,用10%SDS浸透,倒掉多余液体,将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上,菌落面在上,注意防止滤膜底面存有气泡。

④5min后,将滤膜转至用变性溶液(0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸湿的滤纸上,放置10min。

⑤将滤膜转至中和溶液(1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L Tris-HClpH8.0)浸湿的滤纸上,放置10min,重复中和一次。

⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上,放置10min,SSPE配成20×贮备液:3.6mol/lNaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4),20mmol/L EDTANa2(pH7.4)。

⑦将滤膜用滤纸吸干,80℃真空烘干2h。

2.斑点杂交(Dot blot)。是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品,为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。

(1)DNA斑点杂交:

①先将膜在水中浸湿,再放到15×SSC中。

②将DNA样品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。

③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。

④将膜烘干,密封保存备用。

(2)RNA斑点杂交:与上法类似,每个样品至多加10μg总RNA(经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化),方法是将RNA溶于5μl DEPC水,加5μl甲醛/SSC缓冲液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA变性,然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上,烘干。

(3)完整细胞斑点杂交:应用类似检测细菌菌落的方法,可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测,将整个细胞点到膜上,经NaOH处理,使DNA暴露、变性和固定,再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本,因为它使细胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法还高,又不影响与32P标记的探针杂交,但它不适用于非放射性标记探针,因为DNA纯度不够,会产生高本底。

3.Southern印迹杂交(Southern blot)。是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后经碱变性,Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着,附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置,从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

(1)琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段(0.3~25kb)分离开,分离大分子DNA片段(800-12000bp)用低浓度琼脂糖(0.7%),分离小分子片段(500~1000bp)用高浓度琼脂糖(1.0%),300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。根据分离样品品质,分离速度和分辨率要求的不同,可选用不同规格的电泳槽。

电泳时,同时将分子量标记物加到旁边孔中,便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜,电泳完毕,将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min,也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中,在254nm短波透射灯下拍照,加橙黄色滤色镜,使用高速一次成像胶片,光圈f4.5,曝光20-40s。

(2)硝酸纤维素膜吸印。

[1]将胶片切成合适大小,切去右上角作为记号。

[2]将胶片放进盛有变性缓冲液(1.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH)的盘中轻晃15min。

[3]换到中和缓冲液(1mol/l Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH)的盘中轻晃30min。

[4]裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸(可用卫生纸),都与胶的大小相同(硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大,否则易形成旁路)。先将硝酸纤维素膜浸到水中,再放入10×SSC缓冲液,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。

[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸,起灯蕊作用,盘中加入少量10×SSC缓冲液(2.5cm厚),不能没过平板,使3mm滤纸充分饱和。

[6]将胶倒扣在3mm滤纸上。

[7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上,对齐。铺膜时从一边逐渐放下,防止产生气泡,有气泡时,可用吸管赶出,不能让膜与胶下的滤纸直接接触。

[8]膜上放一张3mm滤纸,不能与胶接触。

[9]上面加吸印纸及重物(500g左右)。

[10]通过滤纸的灯芯作用,平盘中的缓冲液就会通过胶上移,从而将DNA吸印到膜上,及时更换浸湿的吸印纸,在室温下转印过夜。

[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出,在6×SSC中洗一下。

[12]自然干燥,80℃烤2h。

[13]这是的膜就可进行杂交,或室温密封保存。

4.Northern印迹杂交(Northernblot)。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似,只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后用低盐缓冲液洗脱,否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB,因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小,可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳,之后将标记物切下、上色、照像,样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min,光在水中就可脱色,在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或在白炽灯下暴露过久,会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时,甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。

<1>试剂:

10×MSE缓冲液:0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸钠,1mmol/L EDTA pH8.0。

5×载样缓冲液:50%甘油,1mmol/lEDTA,0.4%溴酚蓝。

甲醛:用水配成37%浓度(12.3mol/L),应在通风柜中操作,pH高于4.0。

20×SSC;

去离子甲酰胺;

50mmol/LNaOH(含10mmol/L NaCl);

0.1mol/LTris,pH7.5。

<2>步骤:

[1]40ml水中加7g琼脂糖,煮沸溶解,冷却到60℃,加7ml10×MSE缓冲液,11.5ml 甲醛,加水定容至70ml,混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后,去掉梳子和胶布,将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

[3]使RNA变性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml,甲醛3.5ml,去离子甲酰胺10ml。

[4]55℃加热15min,冰浴冷却。

[5]加2ml5×载样缓冲液。

[6]上样、同时加RNA标记物。

[7]60伏电泳过夜。

[8]取出凝胶,水中浸泡2次,每次5min。

[9]室温下将胶浸到50mmol/l NaOH和10mmol/LNaCl中45min,水解高分子RNA,以增强转印。

[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。

[11]20×SSC洗胶1h。

[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。

[13]取出硝酸纤维素膜,80℃真空烘烤2h。

5.组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)。组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落原位杂交不同,菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交,而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交,因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如,对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示按规定序列的位置,对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布;与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外,原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。

用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA,也可以是RNA探针。通常探针操作的长度以100-400nt为宜,过长则杂交率减低。最近研究结果表明,寡核苷酸探针(16-30nt)能自由出入细菌和组织细胞壁,杂交效率明显高于长探针,因此,寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交优选探针。

探针的标记物可以是放射性同位素,也可以是非放射性生物素和半抗原等,放射性同位素中,3H和35S最为常用,3H标记的探针半衰期长,成像分辨率高,便于定位,缺点是能量低,35S标记探针活性较高,影像分辨率也较好,而32P能量过高,致使产生的影像模糊,不利于确定杂交位点。

原位杂交中,标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要,去除蛋白质的方法是,用0.2mol/l HCl处理载玻片,用蛋白酶K消化,然后用不同浓度的乙醇脱水。原位杂交还是一种新技术,发展很快,在敏感性、特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。

6,固相夹心杂交。Dunn等最早介绍了夹心杂交类型,Ranki等又作了进一步的改进,夹心杂交法比直接滤膜杂交法有两个主要的优点:(1)样品不需固定,对粗制样品能做出可靠的检测;(2)用夹心杂交法比直接滤膜杂交法特异性强,因为只有两个杂交物都杂交才能产生可检测的信号。

固相夹心法杂交需要两个靠近而又互相重叠的探针,一个做固相吸附探针,另一个作标记检测探针,样品基因组内核酸只有使这两个探针紧密相连才能形成夹心结构,需要注意的是两探针必须分别亚克隆进入两个分离的非同源载体内,以避免产生高的本底信号。

夹心杂交法可用滤膜和小珠固定吸附探针,使用小珠可更好地进行标准化试验和更容易对小量样品进行操作。Dahlen等利用微孔板进行夹心杂交,可同时进行大量样品检测,他们先吸附DNA探针加到凹板中,然后用紫外线照射使其固定到塑料板上,用微孔板进行夹心杂交还可直接用于PCR技术。应用光敏生物素标记探针,检测PCR产物的敏感性和用32P标记探针(3×108cpm/μg)作16h放射自显影的Southern杂交的敏感性一样。用微孔板杂交的其它优点还有可同时操作多份样品,加样、漂洗和读结果等步骤可以自动化。

7. 其它杂交类型

(1)固化探针杂交。该法较少使用,原理是使未标记固化探针通过杂交与靶RNA或DNA结合,漂洗后,用酶标抗DNA:RNA抗体或抗DNA:DNA抗体与杂交物结合,将乳胶颗粒收集,吸附到膜上后漂洗、加入底物显色并进行测定,探针浓度为2μg/ml,80℃杂交,可在10-15min完成,检测的敏感性为5×106靶序列。

(2)反向杂交:这个杂交类型是用标记的样品核酸与未标记的固化探针DNA杂交,故称为“反向杂交”。这种杂交方法的优点是在一次杂交中,可同时检测样品中几种核酸。这种杂交方式主要用于进行中的核转录试验和多种病原微生物的检测,前者是在转录过程中标记RNA探针,后者可用光敏生物素制剂BPA标记样品核酸。

8.固相膜核酸杂交膜的选用。杂交膜是一种多孔、表面积很大的固相载体,核酸一旦固定在上面,就可用杂交法进行检测。最常使用的膜是硝酸纤维素膜,用于放射性和非放射性标记探针都很方便,产生的本底浅,与核酸结合的化学性不是很清楚,推测为非共价键结合,经80℃烤干2h和杂交处理后,核酸仍不会脱落。硝酸纤维素膜的另一特点是只与蛋白有微弱非特异结合,这在使用同位素探针中尤为有用。硝酸纤维素膜的缺点是结合核酸能力的大小取决于转印条件和高浓度盐(>10×SSC),与小片核酸(<200bp)结合不牢,质地脆,不易操作。

尼龙膜在某些方面比硝酸纤维素膜好,它的强度大,耐用,可与小至10bp的片段共价结合,在低离子浓度缓冲液等多种条件下,它们都可与DNA单链或RNA紧密结合,且多数膜不需烘烤。尼龙膜韧性好,可反复处理与杂交,而不丢失被检标本,它通过疏水键和离子键与核酸结合,结合力为350-500μg/cm2,比硝酸纤维素膜(80-100μg/cm2)强许多。尼龙膜的缺点是对蛋白有高亲合力,不宜使用非同位素探针。

9.“噪音”的排除。“噪音”(noise)是固相膜杂交方法常遇到的问题,指标记DNA结合到空白膜上的放射性计数,即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件,二是选择合格的杂交反应液和对膜进行处理。研究发现,随着离子强度的增加,空白膜(未固定DNA对照膜)上的“噪音”水平增加,而在50%甲酰胺-6×SSC的杂交反应液中“噪音”最低。目前,最常使用的消除噪音的方法是用Denhardt液与固定膜预保温,这样可以充分封闭膜上的多条非特异结合位点。

(三)液相核酸分子杂交类型

1、吸附杂交

(1)HAP吸附杂交,羟基磷灰石层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法,在液相中杂交后,DNA:DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上,通过离心使吸附有核酸双链HAP沉淀,再用缓冲液离心漂洗几次HAP,然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。

(2)亲和吸附杂交:生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交,杂交物吸附到酰化亲和素包被的固相支持物(如小球)上,用特异性抗DNA:RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应,加入酶显色底物。这个系统可快速(2h)检测RNA。

(3)磁珠吸附杂交:Gen-Probe公司最近应用丫啶翁酯(Acridinium ester)标记DNA探针、这种试剂可用更敏感的化学方法来检测,探针和靶杂交后,杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠(阳离子磁化微球体)上,溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出,经过简单的漂洗步骤,吸附探针的小珠可用化学发光测定。

2、发光液相杂交

(1)能量的传递法。Heller等设计用两个紧接的探针,一个探针的一端用化学发光基团(供体)标记,另一个探针的一端用荧光物质标记,并且这两个探针靠得很近,两个靠得很近的探针用不同的物质标记(光发射标记)。当探针与特异的靶杂交后,这些标记物靠得很近,一种标记物发射的光被另一种标记物吸收,并重新发出不同波长的光,调节检测器使自动记录第二次发射光的波长,只有在两个探针分子靠得很近时,才能产生激发光,因此这种方法具有较好的特异性。

(2)丫啶翁酯标记法。丫啶翁酯标记探针与靶核酸杂交后,未杂交的标记探针分子上的丫啶翁酯可以用专门的方法选择性除去,所以杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。该法的缺点是检测的敏感度低(1ng的靶核酸),仅适用于检测扩增的靶序列,如rRNA或PCR扩增产物。

3、液相夹心杂交

(1)亲和杂交 在靶核酸存在下,两个探针与靶杂交,形成夹心结构。杂交完成后,杂交物可移到新的管或凹孔中,在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上,而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针,及125I标记检测探针。这个系统的敏感性可检测出4×105靶分子,该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。

(2)采用多组合探针和化学发光检测 第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针,它们有50个碱基长,其中含有30个细菌特异序列碱基和20个碱基的单链长尾;第二类探针是固相吸附探针,它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多体(标记探针),液相吸附探针和靶杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上。典型的试验可有25个不同的检测探针和10个不同的吸附探针,第一个标记检测探针上附着很多酶(碱性磷酸酶或过氧化物酶),可实现未标记检测探针的扩增,使用化学发光酶的底物比用显色反应酶的底物敏感。这个杂交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原体、淋球菌以及质粒抗性的检测,敏感性能达到检测5×104双链DNA分子。

4、复性速率液相分子杂交

这个方法的原理是细菌等原生物的基因组DNA通常不包含重复顺序,它们在液相中复性(杂交)时,同源DNA比异源DNA的复性速度要快,同源程度越多,复性速率和杂交率越快。利用这个特点,可以通过分光光度计直接测量变性DNA在一定条件下的复性速率,进而用理论推导的数学公式来计算DNA-DNA之间的杂交(结合)度。

第三节 基因扩增技术(PCR)

聚合酶链反应(polymerasechain reaction简称PCR)又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点,已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。

PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的,主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来,PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。

为了使PCR技术在临床上迅速得以普及,我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革,使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染,从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。

一、PCR的基本原理和基本程序

PCR扩增DNA的原理是:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链,然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物,即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段,一般需20-30个碱基对,过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后,以靶DNA单链为模板,经反链杂交复性(退火),在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷(dNTP)为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用,而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列,并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程,使每次循环延伸的模板又增加1倍,亦即扩增DNA产物增加1倍,经反复循环,使靶DNA片段指数性扩增。

PCR的扩增倍数Y=(1+E)n,这里Y是扩增量,n为PCR的循环次数。E为PCR循环扩增效率。设PCR扩增效率E为100%、循环次数n=25次,靶DNA将扩增到33554432个拷贝,即扩增3355万倍:若E为80%、n=20、则扩增数量将下降到1408865拷贝,即扩增产物约丢失93%,若E=100%,n=20,则扩增数量减少1048576个拷贝,扩增产物约减少97%。可见PCR循环扩增效率及循环次数都对扩增数量有很大影响。PCR扩增属于酶促反应,所以,DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升,随着靶DNA片段的逐渐积累,当引物—模板/DNA/聚合酶达到一定比值时,酶的促化反应趋于饱和,此时靶DNA产物的浓度不再增加,即出现所谓平台效应。PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率,起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。另外酶的含量,dNTp 浓度,非特异性产物的扩增都对到达平台期时间有影响。

二、PCR的特点

(一)特异性高:首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymeraseI的Klenow大片段,其酶活性在90℃会变性失活,需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段,同时引物是在37℃延伸(聚合)易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差,1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶,在热变性处理时不被灭活,不必在每次循环扩增中再加入新酶,可以在较高温度下连续反应,显着地提高PCR产物的特异性,序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中,单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一,足可以提供特异性分析,选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。

(二)高度敏感:理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上,实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞,或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。

(三)快速及无放射性:一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增,加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成,不用分离提纯病毒,DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物,可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测,省去费时繁杂的提纯程序,扩增产物用一般电泳分析即可,不一定用同位素,无放射性易于推广。

(四)简便:扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆,摆脱繁琐的基因方法,可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点,扩增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相应酶切位点的载体中。

(五)可扩增RNA或cDNA:先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA,再将得到的单链cDNA进行PCR扩增,即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%,也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段,有些外显子分散在一段很长的DNA中,难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板,则可将外显子集中,用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。

三、PCR方法

(一)试剂

(1)引物:决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同,选用不同引物,每种病原微生

物都有自己特异的引物。

(2)耐热的DNA聚合酶:此酶是从耐热细菌中分离出来的,能耐受高温90℃-100℃。

(3)10×PCR缓冲液:500mmol/l KCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。

(4)5mmol/L dNTP贮备液:将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并,加入灭菌去离子水溶解,用NaOH调pH至中性,分装每份300μl,-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。

(5)DNA模板:用处理液将待测标本处理,不同处理方法、操作各异,但目的是暴露标本中被检测的DNA。

(二)操作程序

过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中,然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下:

(1)向一微量离心管中依次加入

DNA模板 102-105拷贝

引物  各1μmol/L

dNTP    各200μmol/L

10×PCR缓冲液1/10体积

ddH2O 补到终体积(终体积50μl-100μl)

混匀后,离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用,现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液,引物,ddH2O混合在一起,反应体积为20-25μl,只要试验人员加入处理好的样品就可以了。

(2)加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。

(3)冷至延伸温度时,加入1-5u Taq DNA聚合酶,离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。

(4)PCR的循环程序为:94℃变性30s,55℃退火20s,然后在72℃延伸30s,共循环30-35次。最后一次循环结束后,再将反应管置72℃温育5min,以确保充分延伸。

PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解,就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA,再用PCR进行特异性的DNA扩增,应用这种方法,他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA,操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚,0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂,离心除去二甲苯,用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质,将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min,然后按前述PCR方法进行DNA扩增。

在应用PCR方法检测RNA病毒时,首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增,因为PCR只能对DNA模板进行扩增,我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR,简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录,反转录需要在反转录酶的作用下完成。

四、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响

(一)模板核酸

PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增,处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当,未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。

(二)引物

PCR结果的特异性取决于引物的特异性,扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此,引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析(HPLC)纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”,其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此,PCR所用引物质量要高,且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月,液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。

PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果,当PCR引物量太低,则产物量降低,会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成,还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物,与靶序列竞争DNA聚合酶,dNTP底物,从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2~1μmol/L为宜,但我们实验发现,最适浓度远远低于此浓度。

(三)缓冲液

PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液,20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为-0.021/℃。因此,20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L,pH8.9,有时会增加产量。

反应混合液中50mmol/L以内的KCl,pH8.9有利于引物的退火,50mmol/lNaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+,其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明胶(0.01%)或Tween20(0.05% ~0.1%)有助于酶的稳定,反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用,尤其在扩增长片段(此时延伸时间长)时,加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。

(四)Mg2+

Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性,这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火,模板与PCR产物的解链温度,产物的特异性,引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时,酶活力显著降低;过高时,通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板,引物和dNTp的磷酸基团均可与Mg2+结合,降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。

(五)三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)

四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)是DNA合成的基本原料,PCR反应中dNTP含量太低,PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入(即所谓的“热力背信”),因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50~200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。

(六)耐热DNA聚合酶

PCR之所以能得到广泛应用,主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus(Taq)中分离出的热稳定性DNA聚合酶,使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序,也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高(79℃),使引物在高温下进行退火和延伸,这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中,每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳,酶的浓度太低会使扩增产物产量降低,如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。

(七)温度循环参数

1.变性温度与时间

PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开,才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高,时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响TaqDNA聚合酶的活性,所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要,需时间较长,因模板DNA的链比较长。

2.复性温度与时间

变性温度是PCR反应成败的关键,复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好,但是容易出现引物与靶DNA的错配,增加非特异性结合,温度太高不利于复性,大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后,复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。

3.延伸温度与时间

引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性,又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,也会影响其产量,72℃时,核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S,这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而,延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增,延伸时间要长些。

4.循环数:

循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下,最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外,酶活性不好,或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。

五、PCR标本的制备

在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应,并使之达到自动化之后,PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单,而且,许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用,因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外,处理标本可使待扩增DNA暴露,能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多,我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染,且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃,10min,离心取上清作为PCR模板即可。

六、PCR实验中常见问题对策

所有实验结果都有成功或失败,实验的失败可能是应该出结果而没有出,我们把它称作假阴性,不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。

(一)假阴性:出现假阴性结果最常见的原因是:Taq DNA聚合酶活力不够,或活性受到抑制;引物设计不合理;提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当;循环次数不够。所以在实验中出现假阴性失败时,首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶、增加5-10次循环,一般都会获得成功。如果没有成功应检查PCR扩增仪的温度是否准确,采集标本是否有问题。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时,要注意用活力高质量好的酶。同时在提取PCR模板时,应特别注意防止污染抑制酶活性物质(如酚、氯仿)的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高,但也不允许有破坏性有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件及特异性是引物与靶DNA良好的互补,尤其是要绝对保证引物的3′端与靶基因的互补。对变异较大的扩增对象,宜采用巢式(Nested)PCR或double PCR。在进行PCR操作时应注意Mg2+的浓度要合理。PCR反应的各温度点的设置要合理。

(二)假阳性:PCR结果的假阳性是对被检测标本而言,而反应系统中所扩增的产物是真实的。因为PCR技术高度灵敏,极其微量的靶基因污染都会造成大量扩增,而造成结果判断上的失误,所以污染是PCR假阳性的主要根源。PCR的污染主要是标本间的交叉污染和扩增子的污染。出现假阳性结果的另一种可能是样品中存在有靶基因的同源序列。为了避免因污染而造成的假阳性,PCR操作时要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序,使用一次性吸头。

七、PCR扩增产物的分析法

PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的,根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小,有助于扩增产物的鉴定,点杂交除可鉴定扩增产物外,还有助于产物的分型;Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小,增加检测的特异性与敏感性,最近发展的一系列产物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于产物的精确分析。

(一)凝胶电泳分析法

PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以前者最常用,通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中,仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解,稍冷后倒入电泳槽。

电泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去离子水漂洗2次,每次15min,于UV灯下观察结果并拍照。

凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小,检测扩增的情况,还可以用来纯化扩增产物。

(二)点杂交

当扩增产物是多条带时,用点杂交更合适。这种方法的基本过程是,首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,再用放射性或非放射性标记物标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变DNA的突变类型,用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同位素32P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑,对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作用。但是,由于同位素不稳定和放射性危害,不能常规用于临床或法医检验,用非放射性物质(生物素、荧光素和地高辛等)标记的寡核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高,使用方便、安全、检测速度快。

(三)微孔板夹心杂交法

该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上。然后,再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域杂交,漂洗后显色即可判断结果,该法需要两个杂交过程来检测一个产物,因此,其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测,其敏感度可达5个HBvDNA分子。此法的敏感性和特异性与PCR 32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简便、快速、避免了同位素标记探针的危害,显色反应类似于临床常规应用的ELISA,适于临床实验室常规应用。

(四)PCR-ELISA法

本法避免了电泳和杂交的步骤,适于常规ELISA记数仪检测。因为5'端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列。因此,可以通过修饰一个引物的5′端使其携带便于PCR产物固定的功能基因,而通过另一引物5′-端的修饰使产物便于检测。

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