第三章 淋病

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淋病(Gonorrhea)是由淋病双球菌引起的泌尿生殖系统的化脓性感染。是最常见的性病之一,其主要表现是淋菌性尿道炎和宫颈炎。淋球菌还可以由尿道或宫颈局部扩散感染,引起附睾炎盆腔炎;也可以经血行传播引起播散性淋病。此外也可引起眼、咽部、直肠的感染;还有一部分患者虽然已被淋球菌感染,但在临床上不出现症状,称为无症状淋病。由于产青霉素酶等耐药菌株出现,给防治和控制本病带来了严重困难。祖国医学对淋病的记载早于公元前2-3世纪的《黄帝内经·素问》,公元7世纪隋代巢元方所著的《诸病源候论》均描述过本病,公元10世纪宋代以后,关于淋病的名称更为繁多,但后来常把淋、癃、浊三个不同疾病合在一起,浊指精病,即白浊,与现代描述有相似之处。Galen(公元130年)用希腊文Gonorrhea来形容淋病。Goho为精子之意,rhea为流动,Gonorrhea意为“精子流动”(flow of seed),说明当时对精液与尿道内脓液混淆不清。

1767年John Huntor作了一个大胆的试验,将患淋病患者的脓液种植到自己身上,由于此患者同时患有梅毒,因而他同时患上了淋病和梅毒,最后死于梅毒性主动脉炎。当时就认为淋病是梅毒的早期病变,19世纪中叶以前,人们曾把二者当成同一疾病。

1897年Albert Neisser在患者尿道、阴道及新生儿眼内脓液中找到了淋球菌,故将淋球菌命名为淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae),三年后Leistikow和Loffler在体外分离培养成功。1885年Bumm在人、牛或羊的凝固血清上培养出该菌,并接种于健康人的尿道内亦产生同样的症状,淋球菌作为淋病的致病菌才得以确立。但是淋病与衣原体感染在20世纪初仍混为一谈。对症状较轻,尿道分泌物稀薄者认为是慢性淋病,直到应用青霉素将淋病治愈后,才认识到这种尿道炎为另一种性病。

人类是淋菌的唯一宿主。淋球菌对低等动物无致病能力,曾多次将人体尿道内含有淋球菌的脓液移植于兔子眼内,试图引起淋球菌结合膜炎,始终未获成功,说明人类缺乏杀灭淋球菌的能力。所以淋球菌只能侵袭人类。对于低等动物并无侵犯能力。

70年代以后,有关淋病的研究取得了进展,80年代对淋球菌的基因结构及其发病机制作了许多研究,希望从免疫学方面来控制淋病,但至今尚未成功。

淋病的治疗也经过一个漫长的历程,早期用药物尿道内灌注,1935年开始用磺胺,1938~1940年开始用青霉素,1945年美国已报道在临床上出现了有耐青霉素的淋菌性尿道炎病人,1960年开始检测淋球菌对青霉素的敏感性,1976年美国正式分离出产青霉素酶的淋球菌菌株(Penicillinase-ProducingNeisseria Gonorrhoeae,PPNG),近年来又有耐壮观霉素菌株的报道。

第一节 病原学

淋病的病原体是淋病双球菌,属奈瑟菌属。1879年,Neisser首次分离出淋病双球菌,所以淋病双球菌又称为奈瑟双球菌(Neisseria Gonorrhoeae)。1885年Bamm在凝固血清培养基上培养淋球菌获得成功。

淋球菌的形态与脑膜炎双球菌相似,呈园形,卵园形或肾形,常成对排列,邻近面扁平或略凹陷,大小为0.6μm×0.8μm,革兰氏染色阴性,呈粉红色。美蓝染色呈蓝色。急性期病人淋球菌常见于分泌物白细胞的细胞内,而慢性期多在白细胞外。淋球菌的抵抗力较弱,怕干燥,喜欢在潮湿、温度为35~36℃、含2.5%-5%二氧化碳环境中生长。在完全干燥的环境中只能存活1~2小时,在微湿的衣裤、毛巾、被褥中能生存18-24小时,而在50℃时仅存活5分钟。淋球菌对常用的杀菌剂抵抗力很弱,1:4000硝酸银7分钟可将其杀死,在1%的石碳酸内3分钟死亡。

淋球菌的外膜由脂多糖、外膜蛋白及菌毛组成,且有寄生和致病作用。

菌毛(Pili)由多肽组成,有抗原性,其终端的氨基酸排列较恒定,而中段及羧基端的氨基酸排列顺序常发生改变而决定不同菌株的菌毛的抗原多样性。菌毛与淋球菌的粘附性有关,同时也有抑制白细胞吞噬的作用。培养20小时的菌落,其细胞表面具有菌毛,具有传染性。菌落衰老时菌毛亦消失,接种尿道不产生尿道炎。

淋球菌的外膜蛋白至少有三种,其中蛋白I为主蛋白,占外膜蛋白的60%,不同淋球菌的蛋白I的抗原性不同。该抗原性质稳定,故可以以此制成单克隆抗体对淋球菌进行血清学分型。它以两种形式表达即PIA和PIB。它可在细胞膜上形成孔道。使水溶性物质、其他对细菌代谢有重要作用的物质及某些抗生素可通过细胞膜进入细胞内。蛋白Ⅱ与淋球菌同人类上皮细胞、白细胞的粘合及细胞间的粘合有关,具有热修饰性。蛋白Ⅲ具有还原修饰性,又称Rmp,有强免疫原性,与同种其他奈瑟氏菌有交叉反应,能阻断其他抗体的杀菌作用。近年还发现有铁调节性蛋白称Frp,在缺铁时表达铁的受体。

脂多糖为淋球菌重要的表面结构之一,为淋菌的内毒素,与粘膜下和体内补体协同引起炎症反应、与淋球菌的毒力、致病性和免疫性有关。现已鉴定6种抗原性不同的淋球菌脂多糖。

第二节 淋球菌的遗传学

了解它的遗传机制,对于掌握其发病机制的基础知识,对于临床实践应用,都具有重要的意义。遗传方面的研究对于了解临床分离物中对抗生素的抗药性的产生是非常有用的。目前,遗传研究工作的主要方面是使用细胞遗传技术去了解淋球菌感染的发病机制,去鉴别那些和感染有直接关系的菌体成分。

一、遗传物质的交换机制

淋球菌和其他细胞一样,DNA是其遗传物质。绝大部分DNA存在于细菌的染色体中,另一部分以质粒的形式存在。质粒是一些非常小的环状DNA。大多数淋球菌株至少有一个质粒,也可以没有或有多个大小不同的质粒。

在细菌中,基因从一个细菌到另一个菌体的传递方式可能有三种:(1)转化:指一般外源性基因进入菌体,并整合到宿主菌的染色体中。所有的淋菌都可以吸收、整合,表达来自其他菌体的DNA。所以淋球菌都具有转化能力。有菌毛淋球菌的转化能力明显高于无菌毛淋球菌变异株。有菌毛的淋球菌在其生长过程中的任何时期都可以发生转化。淋球菌可以被质粒的和染色体的DNA所转化;(2)结合:结合是淋球菌遗传信息进行交换的另一种形式。当淋球菌在互相接触时进行DNA转移交换。配对结合过程和遗传信息的交换是由一个非常巨大的、24.5兆道尔顿的质粒所介导的。这种质粒能够在不同的淋球菌菌株之间转移其耐药质粒。耐药质粒的转移不仅可发生在淋球菌之间,也可以发生在淋球菌和其他类型的细菌之间,包括其他奈瑟菌以及大肠杆菌之间转移。所以,结合对于体内耐抗生素质粒的扩散是十分重要的,它对研究质粒交换的机制十分有意义;(3)转导:指供体细菌的DNA通过噬菌体传给受体细菌,再通过重组嵌入受体菌的DNA中。在淋球菌遗传物质交换机理的研究中,人们只发现了转化和结合这两种方式。

从伴有播散性淋球菌感染的患者身上分离出的菌株一般都具有许多共同的表型特性,在那些无并发症的尿道生殖器感染的菌株中很少发现这些特性。这些特性是对正常人血清内抗菌物质的抵抗力,对青霉素的敏感性,以及在生长时对精氨酸、次黄嘌呤以及尿嘧啶的需要。这些菌株一般具有和外膜蛋白I相关的特殊的抗原决定簇。转化的方式对于研究这些不同表型的出现是由于某个单一的遗传事件或者是多基因的突变是非常有用的。

淋球菌表面结构的组成成分和毒力之间存在着一定的关系。即是同一淋球菌株的变异株之间,其表面蛋白的成份也不相同。在同一菌株中,有菌毛的淋球菌的毒力明显高于无菌毛的菌株。变异菌在某一组或数组外膜蛋白Ⅱ之间也可以出现差异。特殊的膜蛋白Ⅱ与菌体的某些性质,如对血清物质的敏感性、耐药性、以及标本分离部位,感染类型有关。具有不同的表面蛋白Ⅱ的变异株之间的转换频率相当高,每个细菌每繁殖一代为10-3。对于淋球菌表面不同位点的遗传和功能了解甚少。只知道少数几个遗传位点能够影响外膜的成份,但其使用机制尚不了解。特殊的表面结构和菌株的毒力增加有关,但是这种关系是否由于外膜成分的直接作用所致,目前尚不清楚。

二、淋球菌的耐药性

研究表明,淋球菌共有三种耐药性,其一是染色体介导的,染色体突变逐渐产生的耐药菌株,它使细胞通透性改变,从而对青霉素的耐受性增加2-4倍;其二是质粒介导的,耐药质粒能够编码合成β-内酰胺酶,而破坏青霉素的结构,从而使青霉素失效。其三是质粒介导,染色体介导二者兼有。

1976年首次分离出带有β-内酰胺酶的耐青霉素淋球菌菌株,研究表明这种耐药性是通过质粒介导耐药的,对青霉素(Penicillin)和氨苄青霉素(Ampicillin)耐药。目前PPNG在世界各地播散,非洲和亚洲的许多地区PPNG占50%或更多,给淋病的治疗带来了相当大的困难;1983年美国分离出了β-内酰胺酶阴性由染色体介导的耐药菌株(Chromosomally mediatedresistant Neisseria gonorrheae),(简称CMRNG);1985年首次鉴定出质粒介导的高度耐四环素菌株(TRNG),它是由耐链球菌决定簇Tetm进入淋球菌内,并停留在部分结合质粒衍化而来的新质粒上,该新质粒可传递并具有启动某些β-内酰胺酶质粒的能力。TRNG对四环素、二甲胺四环素和强力霉素耐药。近年又出现耐状观霉素的菌株。PPNG、CMRNG和TRNG的局部地区暴发,已证实系一种营养血清菌型,防治应集中控制耐药菌株。

最近我们在临床实践中发现某些淋病患者对头孢曲松钠有耐药现象,有待于进一步研究。

第三节 流行病学

淋病是一种在世界上广泛流行的性病。我国解放前,淋病的流行十分严重。解放初期淋病占性病的第二位,到60年代中期,淋病在我国基本消灭。随着我国的改革开放,80年代淋病又重新传入我国,从沿海城市向内陆城市蔓延。而且每年发病率增长很快。淋病在性病的发病中属首位。我们基因诊断中心性病专家门诊每年接诊性病患者20000多人,而淋病占60%左右,男性多于女性。女性多为“小姐”。淋病的发病有明显的季节性。每年在7-10份发病率最高。12-3份发病率最低。目前高收入阶层发病下降,普通收入阶层发病率增加,大城市人口感染逐渐下降,中小城市人口感染增加,淋病从城市走向农村,农村病人增多。

淋球菌在世界的流行情况以欧美和非洲一些国家最高,美国1975年发病率为473/10万,1988年为300/10万;乌干达坎帕拉为10000/10万。亚洲国家发病也较惊人,新加坡1980年为630/10万,秦国1985年为408/10万。在美国,淋病发病率在男性中最高,而在妇女中带菌率最高。性活跃者、青少年、贫民、黑人、受教育较少者、未婚者中发病率最高,这些人对淋病起着传播作用。在美国,自1985年以来,白种人淋病的发病率已持续下降,但黑人中无明显下降或仍有增加。有一些淋病的传播与妓女的吸毒有关,妇女或妓女因吸毒后性交易传播淋病。妓女淋球菌感染率在新加坡和台北市阳性培养率为8.5%。在美国科罗拉多州阳性培养率为31%,非洲的Bata地区阳性培养率为51%。

传染途径:

人是淋球菌的唯一天然宿主,淋病患者是传播淋病的主要传染源,淋病主要通过不洁性交而传染。但也可以通过非性接触途径传播,性接触传播是淋病的主要传染形式,成人淋病几乎都是通过性交感染。男性与患淋病的女性一次性交后可有25%的感染机会,性交次数增多感染机会增加。非性接触传播通过污染的衣裤、床上用品、毛巾、浴盆、马桶等间接感染;新生儿淋菌性眼炎多通过淋病母体产道感染引起的。妊娠妇女患淋病,可以引起羊膜腔内感染及胎儿感染,此外还可以通过医务人员的手和器具引起医源性感染,轻症或无症状的淋病患者是重要的传染源。

第四节 发病机理

在正常情况下尿液应该是无菌的,由于尿液不断的冲洗尿道使浸入的微生物很难在泌尿道定居,而淋球菌容易在尿路上寄生,主要是由于淋球菌有菌毛,使得淋球菌对单层柱状上皮细胞和移行上皮细胞,如前尿道、子宫颈、后尿道、膀胱粘膜敏感,极容易粘附在上述细胞之上。淋球菌在酸性尿中(pH<5.5)很快杀死,因而膀胱和肾脏不易被感染,而前列腺液含有精胺及锌,故可受淋球菌感染。

尿道及阴道内的寄生菌群对淋球菌的生长有一定的抑制作用。这些菌群的存在给体内提供了一些自然抵抗力。粘膜表面存在有乳铁蛋白,铁对淋球菌的长生繁殖是必需的,如环境中铁的浓度处于低水平时,则淋球菌的生长受限。淋球菌对不同细胞敏感性不同,对前尿道粘膜的柱状上皮细胞最敏感。因而前尿道最容易被感染,后尿道及膀胱粘膜由移行上皮组成,淋球菌对其敏感性不及柱状细胞,因而被淋球菌感染的机会比前尿道差。舟状窝粘膜由复层鳞状细胞组成,而多层鳞状上皮细胞不易被淋球菌所感染。淋球菌借助菌毛,蛋白Ⅱ和IgA分解酶迅速与尿道、宫颈上皮粘合。淋球菌外膜蛋白I转至尿道的上皮细胞膜,淋球菌即被柱状上皮细胞吞蚀,然后转移至细胞外粘膜下,通过其内毒素脂多糖,补体及IgM的协同作用,在该处引起炎症反应。30小时左右开始引起粘膜的广泛水肿粘连,并有脓性分泌物出现,当排尿时,受粘连的尿道粘膜扩张,刺激局部神经引起疼痛。由于炎症反应及粘膜糜烂,脱落,形成典型的尿道脓性分泌物。由于炎症刺激尿道括约肌痉挛收缩,发生尿频尿急。若同时有粘膜小血管破裂则出现终未血尿。细菌进入尿道腺体及隐窝后亦可由粘膜层侵入粘膜下层,阻塞腺管及窝的开口,造成局部的脓肿。在这个过程中,机体局部及全身产生抗体,机体对淋球菌的免疫表现在各个方面,宿主防御淋球菌的免疫主要依赖于IgG和IgM,而IgA也能在粘膜表面起预防感染作用。患淋球菌尿道炎的男性尿道分泌物常对感染的淋球菌的抗体反应,即为粘膜抗体反应。这些抗体除了IgA外还有IgG和IgM,血清抗体反应方面,在淋球菌感染后,血清IgG、IgM和IgA水平升高,IgA为分泌性抗体,从粘膜表面进入血液,这些抗体对血清的抗体-补体介导的杀菌作用相当重要,它们对血清敏感菌株所致的淋球菌菌血症具有保护作用。一般炎症不会扩散到全身,若用药对症、足量、局部炎症会慢慢消退。炎症消退后,坏死粘膜修复,由鳞状上皮或结缔组织代替。严重或反复的感染,结缔组织纤维化,可引起尿道狭窄。若不及时治疗,淋球菌可进入后尿道或宫颈,向上蔓延引起泌尿生殖道和附近器官的炎症,如尿道旁腺炎、尿道球腺炎、前列腺炎、精囊炎、附睾炎、子宫内膜炎等。严重者可经血行散播至全身。淋球菌还可长时间潜伏在腺组织深部,成为慢性淋病反复发作的原因。这些被感染器官炎症消退后结缔组织纤维化可引起输精管、输卵管狭窄、梗阻,继发宫外孕和男性不育。

第五节 临床表现

淋球菌感染引起的临床表现取决于感染的程度,机体的敏感性,细菌的毒力,感染部位及感染时间的长短。同时和身体的健康状况,性生活是否过度,酗酒有关。根据临床表现,淋病可分为无合并症淋病与有合并症淋病;无症状与有症状淋病;播散性淋病及急性与慢性淋病等。

一、无合并症淋病

(一) 男性无合并症淋病

急性淋菌性尿道炎(急性淋病):潜伏期为1-14天,常为2-5天。初起,为急性前尿道炎、尿道口红肿、发痒及轻微刺痛,继而有稀薄粘液流出,引起排尿不适,约2天后,分泌物变得粘稠,尿道口溢脓,脓液呈深黄色或黄绿色,同时伴有尿道不适症状加重,红肿发展到整个阴茎龟头及部分尿道,出现尿频、尿急、尿痛、排尿困难、行动不便、夜间阴茎常有痛性勃起。可有腹股沟淋巴结肿大,红肿疼痛,亦可化脓。急性症状第一周最严重,若不治疗,持续一月左右症状逐渐减轻或消失。急性前尿道炎发病2周后,约有50-70%的患者有淋球菌侵犯后尿道,表现为尿意窘迫、尿频、急性尿潴留。尿痛特点是排尿终未时疼痛或疼痛加剧,呈针刺样,有时出现会阴坠痛,可出现终未血尿。病情经过1-2周,症状逐渐消失。全身症状一般较轻,少数可有发热达38℃左右,全身不适,食欲不振等。

慢性淋菌性尿道炎(慢性淋病):症状持续2个月以上称为慢性淋菌性尿道炎。因为治疗不彻底,淋球菌可隐伏于尿道体、尿道旁腺、尿道隐窝使病程转为慢性。如患者体质虚弱,患贫血、结核病时,病情一开始就呈慢性经过,多为前、后尿道合并感染,好侵犯尿道球部、膜部及前列腺部。临床表现尿道常有痒感,排尿时有灼热感或轻度刺痛、尿流细、排尿无力、滴尿。多数患者于清晨尿道有少量浆液痂封口,若挤压阴部或阴茎根部常见稀薄粘液溢出。尿液基本清晰,但有淋丝。

(二)女性无合并症淋病

女性原发性淋球菌感染主要部位为子宫颈,淋球菌能够附着于有层次鳞状上皮,用电镜观察淋球菌的感染部位是在宫颈的鳞状—柱状上皮交界处。淋病性宫颈炎患者早期常无自觉症状,因而,潜伏期难以确定。宫颈充血,触痛,脓性分泌物的增多,常有外阴刺痒和烧灼感,偶有下腹痛及腰痛。这些非典型的症状使患者往往不去就诊治疗,因而成为主要的传染源;淋菌性尿道炎常于性交后2-5天发生,尿道口充血,有触痛及脓性分泌物,有轻度尿频、尿急、尿痛,排尿时有烧灼感,按压尿道有脓性分泌物;淋菌性前庭大腺炎常为单侧,在腺体开口处红肿,剧痛,严重时可形成脓肿。有发热等全身症状;淋菌性阴道炎较少见,病程长者症状轻微,有些患者有腹部坠胀,腰背酸痛白带较多,有些患者有下腹痛月经过多等;妇女淋菌性外阴阴道炎,表现为外阴及阴道炎症。阴道脓性分泌物较多,有时阴道及尿道有黄绿色分泌物,排尿疼痛,外阴部红肿。分泌物可流至肛门,引起刺激症状。严重时可感染直肠,引起淋菌性直肠炎。

二、有合并症淋病

(一) 男性有合并症淋病:

淋病性尿道炎有各种合并症,主要有前列腺炎、精囊炎、附睾炎。

1.前列腺炎:急性前列腺炎是淋球菌进入前列腺的排泄管、腺体引起的,有发热、

寒战,会阴疼痛及伴有排尿困难等尿路感染症状。检查时前列腺肿胀、压痛。但是淋球菌不是引起急性前列腺炎的常见病因。淋球菌引起的前列腺主要表现为慢性病变,,其症状轻微,有会阴部不适,阴茎痛,早晨尿道口有“糊口”现象,尿中见到淋丝,前列腺按摩液有脓球及卵磷脂减少,涂片或培养找到淋球菌,肛诊可在前列腺上触到小结节,并有不适或痛感,在排泄管附近排脓形成瘢痕性收缩影响射精,造成不育。

2.附睾炎:一般发生于急性尿道炎后,单侧居多。有低热,附睾肿大疼痛,同侧腹股沟和下腹部有反射抽痛,初起与睾丸界限清楚,渐渐不清,睾丸触痛,肿大,剧烈触痛。尿液常混浊。同时可有前列腺和精囊炎。

3.精囊炎:急性时有发热、尿频、尿急、尿痛,终未尿混浊并带血。直肠检查可触及肿大的精囊同时有剧烈的触痛,慢性精囊炎一般无自觉症状,直肠镜检查出精囊发硬,有纤维化。

4.尿道球腺炎:发生在会阴或其左右,出现指头大小结节、疼痛,急性可化脓破溃,压迫尿道而排尿困难,可有发热等全身症状,进展缓慢。

5.尿道狭窄:反复发作者可引起尿道狭窄,少数可发生输精管狭窄或梗阻,出现排尿困难,尿线变细,严重时尿潴留。继发输精管狭窄,精囊囊肿与不育。

(二)女性有合并症淋病

女性淋病的主要合并症有淋菌性盒腔炎,如急性输卵管炎,子宫内膜炎,继发性输卵管卵巢脓肿及其破裂所致的盆腔脓肿腹膜炎等。多在月经后突然发病,有高热、寒战、头痛恶心呕吐、下腹痛,脓性白带增多。双侧附件增厚、压痛。

三、其他部位淋病:

1.淋病性结膜炎:新生儿多出生后2-3天出现症状,多为双侧,眼睑红肿,有脓性分泌物,成人多为自我接种,常为单侧,表现同新?

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淋菌性败血症:患者开始发热,体温可高达40℃,但通常是在38℃-40℃之间,寒战却不常见,有部分病人发生皮肤丘疹瘀斑脓疱性、出血性或坏死性皮肤损害,部分皮损处有疼痛症状。在皮损处,用荧光免疫染色可查到淋球菌或培养有淋球菌生长,PCR检测淋球菌DNA阳性。皮损的病理组织表现为浅表性溃疡并有脓液形成,真皮及皮下组织弥漫性炎症,有多形核白细胞浸润,并累及小血管,有血栓形成和局限性的坏死。

(二)淋菌性关节炎:关节肿胀、疼痛,为一个或数个化脓性关节炎。一般不对称,很少累及髋、肩和脊柱关节。关节液化验有淋病双球菌存在,可导致骨质破坏引起纤维化,骨关节强直

(三)淋菌性角化症:可能是由于淋球菌或其毒素所致,皮损中找不到淋球菌,常与淋菌性关节炎并发,皮损好发部位为手足、踝跟部和腰部。通常为扁平角化性稍隆起的斑片或斑块,呈圆锥形,黄色,或铜红色或灰白色。掌跖的皮损呈角质增生,大片角化。

(四)淋菌性心内膜炎:抗生素使用前几十年中,淋球菌是心内膜炎的主要病原体,目前淋菌性心内膜炎几乎见不到,淋菌性心内膜炎和其他类型心内膜炎有相同的临床表现。心内膜炎时,常累及主动脉瓣或二尖瓣,因瓣膜的快速破坏所致的亚急性或急性心内膜炎,而导致死亡。

(五)淋菌性脑膜炎:不常见,可伴有关节炎和典型皮疹,以区分脑膜炎球菌性脑膜炎

四、淋病对妊娠及新生儿的影响

当女性淋病并发有输卵管炎时,可导致不孕。女性淋病引起不孕症的发病率为20%左右,随着感染次数的增加不孕症发生率升高。对于感染三次以上淋病的妇女,不孕症发生率可达70%。宫颈淋菌性炎症可导致早期破膜,羊膜腔内感染,胎儿宫内感染,胎儿宫内发育迟缓早产等。新生儿因早产,体重低,败血症的发病率和死亡率很高。产后淋球菌上行感染,可引起子宫内膜炎,产褥热,严重时引起产后败血症,新生儿淋病性结膜炎及淋球性妇女外阴阴道炎。

五、实验室检查

淋球菌实验室检查包括涂片,培养检查淋球菌、抗原检测,药敏试验及PPNG测定,基因诊断。

(一)涂片检查:

取患者尿道分泌物或宫颈分泌物,作革兰氏染色,在多形核白细胞内找到革兰氏阴性

双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者,此法阳性率在90%左右,可以初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多,敏感性和特异性较差,阳性率仅为50-60%,且有假阳性,因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少,阳性率低,因此要取前列腺按摩液,以提高检出率。

咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病,因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群。另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查。

(二)培养检查:

淋球菌培养是诊断的重要佐证,培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法,只要培养阳性就可确诊,在基因诊断问世以前,培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer-Martin(TM)培养基和New York City(NYC)培养基。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基,均含有抗生素,可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃,70%湿度,含5%-10%CO2(烛缸)环境中培养,24-48小时观察结果。培养后还需进行菌落形态,革兰氏染色,氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。培养阳性率男性80%-95%,女性80-90%。

(三)抗原检测

1.固相酶免疫试验(EIA):可用来检测临床标本中的淋球菌抗原,在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用,可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。

2.直接免疫荧光试验:通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免

疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高,特异性差,加之实验人员的判断水平,故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。

(四)基因诊断

1.淋球菌的基因探针诊断

淋球菌的基因探针诊断,所用的探针有:质粒DNA探针,染色体基因探针和rRNA基因探针。

(1)质粒DNA探针

① 隐蔽质粒DNA探针,淋球菌质粒分为三种:接合性质粒,分子最大,为36kb DNA; 耐药性质粒包括两个质粒,DNA长分别为5.6kb和7.1kb;隐蔽质粒4.2kb。其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中,其它奈瑟菌不含有此质粒,故可用它的序列作为特异DNA探针检测淋球菌。Torres采用核酸杂交技术检测淋球菌,所用探针为隐蔽质粒。用该探针对134株淋球菌和131株相关菌株的检测,有124株淋球菌杂交反应阳性,占93%,还可与个别其它的奈瑟菌出现交叉反应,对测定探针的敏感性实验表明可检出102CFU淋球菌。研究证明隐蔽质粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色体中(包括不含该质粒的菌株)。因此CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性。Torres等用CPPB基因探针检测了201份临床标本,采用非放射性地高辛标记系统,其敏感性和特异性分别为95%和98%。

② 耐药性质粒DNA探针

淋球菌的抗药质粒可分为:①产青毒素酶淋球菌(PPNG)其β-内酰胺酶阳性;②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌(TRNG)。

PPNG菌株是1976年首次在实验室分离得到的,该菌中含有编码产青毒酶的基因,该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒DNA中,而后者居多,称之为产青毒素酶质粒,质粒有二种,大小分别为7.4kb和5.3kb。Pescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码β-内酰胺酶基因的探针,采用酶化学发光法标记,液相杂交,用测光计测是特异杂交体的光量。在4h内可检测104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株虽对四环素耐药,但通常对β-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感。因此,在实验室药敏检测中可归为敏感细菌。Pescador用抗四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针,该基因介导抗四环素,用酶化学发光标记,液相杂交,4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

(2)染色体探针

染色体探针包括已知功能的基因探针,如菌毛DNA探针和paI基因探针,这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用;未知功能的基因探针,这些探针序列与染色体的特定序列互补,但目前还不知这些基因序列的功能。以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低,检测灵敏度较低,因此一般用的不多,除非有特殊的研究目的。

(3)rRNA基因探针

rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针,该探针的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探针的特点是:①可以增加探针检测的灵敏度,rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子;②rRNA具有进化上的保守性;③杂交方法简便、快速;④由于rRNA的含量较高,标本不需增菌。美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACe C,是以rRNA 及其基因为检测靶序列,采用放射性标记,在2h内可以完成检测,Peter用这种探针检测395个临床标本,结果灵敏度和特异性分别为92.9%,99.4%,他认为PACeC系统筛查临床标本中淋球菌是一个可靠的方法。该探针还可以检测无症状淋球菌感染者,这是目前培养难于达到的。

2、淋球菌的基因扩增检测

上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法,虽然比培养方法在灵敏度,特异性和方便性上有了很大的提高,但其仍有一定的局限性,如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高,PCR技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性,它具有快速、灵敏、特异、简便的优点,可以直接检测临床标本中极微量的病原体。

(1)淋球菌DNA的提取

①培养菌的DNA提取

将培养得到的淋球菌,以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解,裂解液组成为:1m NaCl 1MNaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。将裂解液混匀后煮沸1min,然后用100μl 的1MTris pH7.0中和碱性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次,酚—氯仿抽提一次,然后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA,提取的DNA溶于30μl蒸馏水或TE缓冲液中。

②临床棉拭子标本的提取

将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或PBS缓冲液中挤压洗1min,以便将标本尽量溶于溶液中,将棉拭子弃去,悬浮液于2-3000r/min离心5min,吸去上清液,细胞重新溶于100μl 1×PCR缓冲液,其中含Tween 20 0.45%,蛋白酶K 200μg/ml,细胞悬浮液于50-60℃温浴1h,然后95℃加热10min以灭活蛋白酶K,12000r/min离心10min,上清液含DNA模板。

(2)PCR引物的设计

由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在,同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒,因此很多PCR引物设计在CPPB基因区。

靶基因  引物序列 片段长度(bp)

CPPB NG1 5′GTT TGG CTGGTT GAT TCA AG 3′633

NG2 5′GCA AGA TTTCCG ATTT GGC G 3′

CPPB HO15′GCT ACG CATACC CGC GTT GC 3′ 390

HO2 5′CGA AGA CCTTCG AGC AGA CA 3′

rRNA引物15′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′  206

引物2 5′-ACA CTC GAGTCA CCC AGT TC-3′

CPPB GC15′CTT ATC GTTTGG CTG GTT GAT TC 3′ 435

GC2 5′ACC AAG ACCAAA GGT TTG ACA CTG 3′

GC3 5′ATT TTC CAGTGT CAA AC 3′ 241

GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′

(3)PCR扩增

取淋球菌DNA提取液2μl,加入28μl的反应液中,最终PCR反应液中含dNTP各100μmol/L,引物各0.5μmol/L,TaqDNA聚合酶1U,Mg2+1.5mmol/L,加无菌石蜡油30μl,1000r/min离心30s,进行PCR扩增循环,反应条件:94℃变性1min,然后94℃30s,57℃1min,72℃1min。共30个循环,最后72℃延伸5min。

扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳30min,溴化乙锭染色,紫外灯下可见扩增的DNA荧光条带,分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致。

(4)PCR的灵敏性和特异性

由于CPPB在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有CPPB基因,再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒,因此用CPPB作为靶序列的引物具有极高的敏灵性,实验证明,一般传统一步PCR(GC1-GC2)方法可以检出3个淋球菌,而用单管巢式PCR(GC2-GC4)可以检出≤0.3淋球菌(9个CPPB基因)。这些引物经特异性实验,只能扩增淋球菌的DNA,而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物。

(5)单管巢式PCR方法

是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计,巢式外侧两个引物(GC1,GC2)为25b退火温度比较高(68℃),巢式内侧两个引物GC3-GC4为17b退火温度较低(46℃),PCR反应液的其它成分与一般PCR相同。这样,通过控制退火温度(68℃)使外侧引物先行扩增,经过20-30次循环后(第一次PCR),再降低退火温度(46℃)使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增,该PCR的灵敏度可达到检出0.3个淋球菌。

(6)淋球菌连接酶链反应(LCP)检测方法

目前PCR检测淋球菌的方法被广泛地使用。其特异性,灵敏性不断提高。同时另一种基因诊断技术——连接酶链反应(LCP)也以其高特异,高灵敏性被应用于淋球菌的检测中。LCp 与PCR不同之处在于LCp 用四对引物,所用酶是连接酶。连接酶可以将两条相邻引物连接起来。连接起来的两条引物可以作为另两条引物的模板,后者在连接酶作用下连接,又可作为模板,如此进行30-40次循环。LCP所用的模板处理方法与PCR模板制备相等。LCP所用的探针除了可以设计在CPPB基因上,也可以设计在染色体基因序列上,例如opa-1基因。美国Abbott实验室在opa-1基因的48bp长的区域内设计了4个LCP探针,由于opa-1基因在淋球菌的染色体中有11次重复。因此,该组LCP探针具有高灵敏性和特异性。LCP反应过程:

将模板加入LCP反应液中,LCP反应液:20mmol/L Tris-HClpH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EDTA; 10mmol/L NAD+;10mmol/L DTT,有标记物的两个相邻探针各40fmol/L,未标记的探针各40fmol/L,15U耐热连接酶,反应条件:97℃1s,55℃1s,62℃50s,其40循环。100μl反应产物加入酶标板微孔中,进行显色反应,最后用酶标仪读取光值。根据Buimer的实验证明,LCP在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100%,尿液标本为88.9%,女性宫颈棉拭子标本为95.4%。LCP方法的特异性高达100%,这一点明显高于PCR的特异性,避免了假阳性的发生。

3. 临床基因诊断淋球菌的注意事项

目前临床检测淋球菌的基因诊断方法主要采用PCR方法,但是该方法在临床检测中应注意几个问题。

(1)引物设计 除了以上所列的淋球菌PCR引物外,还可从在其它基因上设计,但

是引物序列应具有特异性。因为细菌的染色体较大,许多基因序列并没有搞清楚;同时细菌之间或近或远有一定的同源性,而且细菌所含质粒序列间也存在同源性,因此设计引物一定要进行基因数据库比较分析,同时进行特异性和灵敏性实验,从中选择引物进行临床检测。

(2)临床标本处理 对临床标本来讲,PCR模板要求越纯越好。这就要求在采集标本时要取到准确的位置,对于无症状患者要适当多采样,以保证采集到病原体细菌。另外由于临床标本成分比较复杂,有时简单处理的标本PCR扩增效果并不理想,这可能是由于杂质过多造成的,需要进一步纯化,如用酚一氯仿抽提法纯化,结果将会好转。这种纯化方法比较麻烦,目前已有商品化的DNA纯化试剂盒,可以较简便地从临床标本中提取高纯度的DNA。

(3)PCR产物的检测方法 不久以前临床PCR检测淋球菌几乎都采用电泳的方法进行PCR产物的鉴定。该方法存在许多问题,如由于肉眼观察的主观性而造成假阳性和假阴性的结果。目前用杂交显色法代替电泳法,提高了结果判断的特异性和灵敏性。

总之,PCR方法与LCP方法比传统的培养法在灵敏性和特异性上有了很大的提高,时间也大大缩短。随着基因诊断技术的不断改进。PCR方法与LCP方法在淋球菌的检测将会成为常规的检测方法。

(五)药敏试验:在培养阳性后进一步作药敏试验。用纸片扩散法做敏感试验,或用琼脂平皿稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),用以指导选用抗生素。

(六)PPNG检测:β-内酰胺酶,用纸片酸度定量法,使用Whatman I号滤纸PP-NG

菌株能使其颜色由蓝变黄,阳性为PPNG,阴性为N-PPNG。

第六节 诊断与鉴别诊断

一、诊断:

必须根据接触史,临床表现及实验室检查综合分析可确定诊断。

(一)接触史:患者有婚外性行为或嫖娼史,配偶有感染史,与淋病患者(尤其家中淋病患者)共物史,新生儿母亲有淋病史。

(二)临床表现:淋病的主要症状有尿频、尿急、尿痛、尿道口流脓或宫颈口、阴道口有脓性分泌物等。或有淋菌性结膜炎、肠炎、咽炎等表现,或有播散性淋病症状。

(三)实验室检查:男性急性淋病性尿道炎涂片检查有初步诊断意义,对女性仅做参考,应进行培养,以证实淋球菌感染。有条件的地方采用基因诊断方法确诊。

二、鉴别诊断

(一)非淋菌性尿道炎:潜伏期较长,为7-21天,尿道分泌物较少或没有,为浆液性或粘液性分泌物,稀薄,症状轻微,无全身症状,其病原体主要为沙眼衣原体,解脲支原体。

(二)念珠菌性阴道炎:主要临床症状为外阴、阴道瘙痒。白带增多,白带呈白色水样或凝胶样。阴道粘膜充血、水肿、白膜粘附,白膜脱落处有轻度糜烂。白膜镜检可见到孢子和菌丝。

(三)滴虫性阴道炎:主要临床症状为阴道瘙痒,分泌物多呈泡沫状。阴道粘膜及宫颈充血明显,有出血点呈特征性草莓状外观。阴道粘膜常出血,分泌物带血性。分泌物中可查出滴虫。

(四)细菌性阴道炎:白带增多,呈灰色,均匀一致,pH值增高,有鱼腥味。涂片可见乳酸杆菌减少,革兰氏阴性菌增多。

第七节 治疗

淋病是一种极容易传染和重复感染的性病。常常合并衣原体等感染。淋球菌容易出现耐药性。易出现合并症及后遗症。在治疗上应引起足够重视。自从1935年应用磺胺药治疗淋病,1944年使用青霉素治疗淋病,均取得了较好的疗效。随着耐青霉素和耐四环素及其他耐药菌株的出现,给淋病治疗带来了困难。

一、治疗原则:

(一)早期诊断、早期治疗;(二)及时、足量、规则的用药;(三)针对不同的病情采用不同的治疗方法;(四)对性伙伴追踪,同时治疗;(五)治疗后随诊复查;(六)注意同时有无衣原体,支原体感染及其他STDs感染。

二、治疗方案:

(一)淋菌性尿道炎和宫颈炎:普鲁卡因青霉素G,480万单位加入100毫升生理盐水静滴;或氨苄青霉素4.0g一次口服也可用针剂静滴;或羟氨苄青霉素4.0g顿服。上述三种药物任选一种。对青霉素过敏者,可用四环素0.5g/次,每6小时一次,共服7日;红霉素类如利君沙、阿齐霉素、罗红霉素等按说明服用,共服7日。

对产生青霉素酶的淋球菌(PPNG)、即对青霉素耐药的淋球菌,当耐青霉素淋球菌流行率达到5%以上时使用青霉素应加舒巴坦钠。另外可选用其它药物;

1. 头孢菌素类,头孢三嗪3.0g静滴,头孢噻肟钠4.0g静滴。

2. 状观霉素,亦称淋必治,2g一次肌肉注射,亦有人主张女性用4g一次肌肉注射。

3.喹诺酮类药物:氟嗪酸,又叫泰利必妥600mg,一次口服,氧氟沙星,200mg静滴。

注:喹诺酮类药物孕妇与儿童禁用。

4. β-内酰胺酶抑制剂和青霉素类药合剂,优立新为青霉素烷砜和氨苄青霉素合剂,1.5g一次肌肉注射,特灭菌为哌拉西林钠加舒巴坦钠,3.0g一次肌肉注射或静滴。

由于淋病患者中有部分同时合并衣原体感染,我们在治疗中常用头孢曲松钠3.0g静滴,口服阿齐霉素,或罗红霉素250mg,每日两次。

(二)淋菌性咽炎:头孢曲松钠3.0g静滴;或氧氟沙星250mg口服,一日三次,或复方新诺明1g/次,一日两次,共7日。

(三)淋菌性直肠炎:头孢曲松钠3.0g静滴,或乐施福定3.0g静滴,或治菌必妥3.0g静滴。

(四)淋菌性眼炎成人,水剂青霉素G1000万单位静脉滴注,每日一次,共5日。

(五)儿童淋病体重≥45kg者按成人剂量给药。体重<45kg的儿童按以下方法给药:头孢曲松钠125mg,一次肌肉注射;或乐施福定25mg/kg,一次肌肉注射;或壮观霉素40mg/kg,一次肌肉注射。

(六)有合并症淋病

①淋病合并输卵管和附睾炎,水剂普鲁卡因青霉素G480万,静滴,一日两次,共7天。PPNG引起者,特灭菌3.0g,一日一次,共7次,壮观霉素2g,肌肉注射每日一次,共10日,或头孢曲松钠,治菌必妥,乐施福定任何一种3.0g静滴,一日一次,共7日。

② 播散性淋病:水剂青霉素G1000万单位静脉滴注,每日一次,共7日,亦可用头孢曲松钠3.0g静脉注射,每日一次,共7日。

第八节 判愈标准

治疗结束后1~2周复查,判愈的标准是:①临床症状消失;②尿液清晰,不含淋丝;③前列腺按摩液或宫颈分泌物涂片及培养检查淋球菌连续2次阴性,可判治愈。

第九节 预后

淋病患者,急性期及时正确治疗可完全治愈。无合并症淋病经单次大剂量药物治疗,治愈率达95%;治疗不彻底,可产生合并症,甚至不育,宫外孕,盆腔炎,尿道狭窄或失明及播散性淋病。因此,应抓紧时机在急性期把淋病彻底治愈。

第十节 预防

1.宣传性传播疾病知识,提倡高尚的道德情操,严禁嫖娼卖淫。

2.使用安全套,可降低淋球菌感染发病率。

3.预防性使用抗生素可减少感染的危险。可在性交前后各服用氟哌酸或阿莫西林,可有效的预防性病的感染。

4. 性伴同时治疗。

5.患者注意个人卫生与隔离,不与家人、小孩尤其女孩同床、同浴。

6.执行新生儿硝酸银溶液或其他抗生素液滴眼的制度,防止发生淋菌性眼炎。

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