第六章 艾滋病(AIDS)

《基因诊断与性传播疾病》在线阅读中医杂集书籍在线阅读

艾滋病全中文译名“获得性免疫缺陷综合征”,简称艾滋病(Acquired immunodefieiency syndrome,AIDS)现已证实是一种病毒使人体免疫功能缺损的一种新的独立疾病。由于传染性强,死亡率高,号称“超级癌症”,已被世界各国普遍重视,构成当今世纪最严重的社会问题之一。无论任何人,特别是医务工作者,只要生活在这个时代,就必须对此病有充分认识,以便迎接21世纪新挑战。

AIDS是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)所致的传染病,主要是通过性接触或血液、血制品及母婴传播传染。HIV特异地侵犯辅助性T细胞(CD4细胞),引起人体细胞免疫严重缺陷,导致顽固的机会性感染、恶性肿瘤和神经系统损害。

1981年美国首先报道该病,1982年由美国疾病控制中心(CDC)正式命名。我国1986年以前音译为“爱滋病”,后来卫生部统一命名为“艾滋病”。本病目前在世界上迅速蔓延,我国目前发病率也明显上升,开始从沿海地区向内地蔓延。艾滋病不仅发生在男性同性恋、妓女、毒隐者等“高危险人群”中,而且,很多病例说明,只要有“危险的性行为”均可能染上艾滋病。因此,对本病应家喻户晓,人人皆知,以防患于未然。

第一节 病因学

自从1981年发现首例艾滋病以来,世界多方科学家对该病进行了艰苦的研究工作。发现HIV-1型病毒是本病的病原体,它对辅助T细胞(CD4)细胞免疫系统有很明显的抑制作用,是该病毒的主要攻击目标,另外,巨噬细胞和单核系统也是具有CD4受体的细胞群,也为靶细胞。通过检查外周血液CD4细胞群的变动数量可以有助于探讨免疫系统异常进展情况。对于本病的科学基础研究做了大量工作和坚持不懈努力,但在防治方面进展不大。

80年代初,国外学者分别从艾滋病患者中分离出了淋巴结病相关病毒,即LAV和人类T淋巴细胞病毒Ⅲ型,当时曾用HTLV-Ⅲ型/LAV代表艾滋病病毒,现已肯定两者是同一病毒。1986年国际病毒分类委员会决定统称为人类免疫缺陷病毒(HIV)。

HIV属逆转录病毒科的慢病毒属。是具有转成二倍体的病毒,能使单链病毒RNA转成双链DNA合而为一以进入宿主细胞的染色体组里,通过病毒聚合酶,及逆性转录酶的催化作用能产生这种新合体。此病毒家庭的成员也在球体中共存,在病毒RNA和聚合酶周围以及搭在特异性罩的糖蛋白的脂质膜中共享一体。

HIV-1在结构上是由2种不同的单位组成,病毒罩(envelope)和病毒角(core),是由一层宿主细胞性双层脂质组成的。2个大罩糖蛋白,gp120和gp41,是由两层联成的,为既有蛋白,gp160,进行酶解裂而产生者,并共同形成一个非同价的外围蛋白复合体。gP41蛋白是分子穿膜部分,而gP120蛋白由病毒表面脱出并起着病毒联接宿主细胞侧的作用。脂质双层也被埋于宿主衍生蛋白之中。再联合之gP160在哺乳和非哺乳细胞干流两者之中进行合成,而且当前正用以制备非HIV感染患者的临床疫苗做试验。同时用于HIV感染患者诱导更有效的免疫反应。

病毒角(virialcore)是由核罩甙(uncleo capsid)和病毒酶组成。前者为4种蛋白质构成;P7、P9、P17以及P24,全部合成为一个53Kol的既存蛋白质,HIV-1蛋白酶可分解它们。

蛋白质P7和P9与病毒RNA紧密联接在一起并形成核角(uncleiu core)。蛋白质P24是病毒酶周围的内罩中之原发蛋白质。蛋白质P17邻接脂质双层内面并在此起稳定病毒微体成分的作用。核罩里的病毒RNA是增添病毒酶的关键:可逆转递酶(RNA-依赖性、DNA聚合酶),戍核酸酶、内切酶(integrase)以及病毒蛋白酶等。

HIV对热敏感,在56℃下经30分钟可灭活,50%乙醇或乙醚、0.2%次氯酸钠、0.1%家用漂白粉,0.3%双氧水、0.5%来苏处理5分钟即可灭活,但对紫外线不敏感。

第二节 基因结构

HIV基因组由两条单链RNA组成,每个RNA基因组约为9.7k,在RNA5′端有一帽结构(m7G5ppp5′GmpNp),3′端有poly(A)尾巴。HIV的主要基因结构和组合形式与其他反转录病毒相同,均由5′末端长重复(long terminal repeat, LTR)、结构蛋白编码区(gag)、蛋白酶编码区(pro)、具有多种酶活性的蛋白编码区(pol)、外膜蛋白(env)和3′末端的长重复LTR区组成。HIV较其他反转录病毒复杂,因为它有较多的调节基因,故称为复杂反转录病毒,以区别于没有或只有很少调节基因的反转录病毒。为最大程度地利用有限的基因,HIV1基因编码区有很多重叠,尤其在基因组3′端。其部分基因如Tat和Rev是不连续的,被插入的内含子分隔成两个外显子。HIV1至少有4个功能性的剪接供体位点和6个剪接受位点。

第三节 流行病学

本病在美国从1978年在纽约发现第1例以后,1979年7例,1980年12例,1981年204例,1982年750例,到1983年已累计发生1739例,逐年直线上升,世界卫生组织宣布到1992年7月底统计已达164个国家,约50万人以上患AIDS,病人随着年代的推进,累积数量不断增加,1995年6月30日,世界卫生组织公布,全世界登记在册的艾滋病病例已接近117万。世界卫生组织认为,实际数要比此数高得多,估计全世界AIDS病例总数可能已超过500万,全世界目前HIV感染者的总数已超过2000万人,每天还约增加600人。死亡病人数近100万人,故称之为世纪绝症。目前以美洲为最多,其次是亚洲,欧洲名列第三。但亚洲HIV感染人数正飞速上升,本世纪未下世纪初期,亚洲处于艾滋病扩散期。在泰国,印度,已从高危人群扩散到一般人群,成人已有20%受感染。产前妇女HIV阳性率高达8%,再过5年,大多数新感染的病例将来自于亚洲。

在我国大陆,自1986年首次发现一美籍阿根廷人在西安发病,经多方检查确诊为AIDS。距世界首例报道AIDS相隔4年。同年在浙江省从血友病病人中又检出HIV感染者4例,为我国首次发现HIV带毒者。此后在我国陆续发现外国人HIV带毒者约17名之多。直至1989年从云南发现HIV带毒者146例,又在北京及河北发现3例HIV带毒者。

进入90年代我国的HIV病情情况更加不可阻挡地迅猛发展,按国家卫生部公布的数字,1990年HIV带毒者为492人,AIDS仅为5名,其后逐年上升,至1995年HIV感染者为3341人,AIDS为117名,专家估计我国实际HIV感染人数应为5万-10万人。这仅仅只有5年其增长速度是十分惊人的。

很多人至今仍认为艾滋病在美国、欧洲和非洲等地多见,实际上随着我国对外开放,经济发展。艾滋病已在我国各地传播开了。我国已报道通过注射进口第Ⅷ因子而感染HIV的病例,各大城市都先后报导了艾滋病的病例,这些情况需引起国人的高度重视。

传染源:为艾滋病患者及HIV携带者。传染性最强的是临床无症状而血清HIV抗体阳性的感染者,其HIV分离率最高。无症状的感染者是艾滋病流行难以控制的重要原因。而病毒阳性而抗体阴性的HIV感染者,则更是危险的传播者,这种现象,在早期和晚期病人比较多见。

传播途径:HIV携带者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、眼泪、骨髓液、尿、母乳等体液,以及脑、皮肤、淋巴腺、骨髓等组织内存在着HIV。一般感染源以血液、精液、阴道分泌物、母乳等为主,很少通过唾液,但也不能否定。

性行为感染:AIDS的本质是一种性病,由性行为感染,特别是男性同性恋者经“肛交”途径感染率最高,血液和精液中HIV的含量几乎相等,故是感染力度最强的感染源,由于肛交直肠粘膜易受损出血,所以,肛交感染HIV较多。性伙伴数越多,性活动开始年龄越小,加上吸毒者,其感染倾向也越高。

男女间性接触感染以嫖娼为甚,因为妓女HIV感染机会多,传染的可能性最大。妓女HIV携带率在美国各大城市近93%。在非洲HIV的传播以男女性行为为主。

血及血制品传染:输入了被HIV污染的血或血液制品,使HIV直接进入体内引起感染以及产褥期感染,静脉扎毒针刺感染。目前尚未见因针灸感染AIDS的发生。血友病患者输入第Ⅶ因子,已发现有1/3患者HIV抗体为阳性。而且现在发现成倍增加。主要原因是对献血者没有进行彻底的HIV检查。在非洲因滥扎毒品使用共同的注射器,其针头部残留有污染的血液而自己直接将病毒注入体内感染非常多见。特别是女性病例更多。器官移植,人工受精也是更重要的传播途径。

母婴垂直传染:携带有HIV的母亲可以经胎(胎内感染)、产道感染及经母乳传播给婴儿。

职业危险因素:医务人员可因针头刺伤或粘膜被污染的血液溅污而接触病毒,已有因被HIV的血液针头刺伤医务工作者而发病的报导,虽然病例不多,但应引起高度重视。

第四节 发病机理

一、HIV感染对CD4T淋巴细胞的影响

HIV病毒为逆转录病毒,所以遗传信息存在于两个相同的RNA单链模板中。该病毒能结合人类具有CD4+受体的细胞,特别是和CD4T辅助淋巴细胞相结合,还能与神经细胞表面的半乳糖神经酰胺结合,逆转录酶可将病毒RNA逆转录为DNA,然后DNA再与人类基因相整合。病毒DNA序列被感染细胞及其子代细胞终身携带。

HIV进入人体后能选择性地侵犯有CD4受体的淋巴细胞,以CD4T淋巴细胞为主。当HIV的包膜蛋白gp120与CD4T淋巴细胞表面的CD4受体结合后,在gp41透膜蛋白的协助下,HIV的膜与细胞膜相融合,病毒进入细胞内。当病毒进入细胞内后迅速脱去外壳,为进一步复制作好准备。最近研究表明,HIV进入细胞内除CD4受体外,还需要细胞表面的蛋白酶同gp120的V3环发生相互作用才能完成。

HIV病毒在宿主细胞复制开始,首先二条RNA在病毒逆转录酶的作用下逆转为DNA,再以DNA为模板,在DNA多聚酶的作用下复制DNA,这些DNA部分存留在细胞浆内。进行低水平复制。部分与宿主细胞核的染色质的DNA整合在一起,成为前病毒,使感染进入潜伏期,经过2-10年的潜伏性感染阶段,当受染细胞被激活,前病毒DNA在转录酶作用下转录成RNA,RNA再翻译成蛋白质。经过装配后形成大量的新病毒颗粒,这些病毒颗粒释放出来后,继续攻击其他CD4T淋巴细胞。大量的CD4+T淋巴细胞被HIV攻击后,细胞功能被损害和大量破坏是AIDS患者免疫功能缺陷的原因。

HIV感染CD4+T淋巴细胞后,首先引起细胞功能的障碍。表现有对可溶性抗原如破伤风毒素的识别和反应存在缺陷,虽然对有丝分裂原植物血凝素(PHA)的反应仍然正常。细胞因子产生减少,IL-2R表达减少和对B淋巴细胞提供辅助能力降低等。当HIV病毒在宿主细胞内大量繁殖,导致细胞的溶解和破裂。HIV在细胞内复制后,以芽生方式释出时可引起细胞膜的损伤。由于HIV可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能,导致细胞病变。HIV还可以感染骨髓干细胞导致CD4+T淋巴细胞减少。

当受HIV感染的CD4+T淋巴细胞表面存在的gp120发生表达后,它可以与未感染的CD4+T淋巴细胞CD4分子结合,形成融合细胞,从而改变细胞膜的通透性,引起细胞的溶解和破坏。游离的gp120也可以与未感染的CD4+T淋巴细胞结合,作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原,使CD4+T淋巴细胞成为靶细胞,受K细胞攻击而损伤。gp41透膜蛋白,能抑制有丝分裂原和抗原刺激淋巴细胞的增殖反应,从而使CD4+T淋巴细胞减少。HIV感染后一般首先出现CD4T淋巴细胞轻度至中度降低,该细胞总数可持续数年不变,反应病毒为免疫应答所抑制。历经一段时间后,CD4+T细胞逐渐进行性下降,表明病毒逐渐逃脱了免疫应答的控制。当CD4+T淋巴细胞一旦下降至0.2×109/L(200细胞/μl)或更低时,则就可出现机会性感染。

二、HIV感染对其他免疫细胞的影响。

HIV感染所致免疫功能的损害,不仅是CD4+T淋巴细胞被破坏,其他免疫细胞也不同程的受到影响。

(一)单核巨噬细胞:因其表面也具有CD4受体,所以也易被HIV侵犯,但其感染率远远低于CD4+T淋巴细胞。研究发现被HIV感染的单核巨噬细胞有播散HIV感染的作用,它可以携带HIV进入中枢神经系统。在脑细胞中受HIV感染的主要是单核— 巨噬细胞,如小胶质细胞。HIV感染的单核 —巨噬细胞释放毒性因子可以损害神经系统。当一定数量的单核— 巨噬细胞功能受损时,就会导致机体抗HIV感染和其他感染的能力降低。并且CD4+T淋巴细胞功能受损,也和单核— 巨噬细胞功能损害有关。

(二)CD8+T淋巴细胞:CD8+T淋巴细胞有对HIV特异的细胞溶解能力,在HIV感染初期,具有抑制病毒复制和传播作用,当CD8+T淋巴细胞功能受损时HIV感染者病情发展。在HIV感染的进展期,HIV-1特异的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的数目进行性减少,说明CD8+T淋巴细胞对HIV特异的细胞溶解活力的丧失,可能与CTL减少有部分关系。HIV选择性变异和由于CD4+T淋巴细胞的破坏也是促使HIV特异性细胞溶解活力丧失的原因。

(三)B淋巴细胞:HIV感染后,可通过多克隆抗体激活B淋巴细胞,使外周血液中B淋巴细胞数量增加,分泌免疫球蛋白,使IgG和IgM的水平增高。同时B淋巴细胞对新抗原刺激的反应性降低。因此,在HIV感染进展时,化脓性感染增加,而对流感A病毒疫苗和乙肝疫苗的抗体反应降低。HIV感染,B淋巴细胞多源活化的机制不明,可能是由于缺乏正常T细胞的调节,B淋巴细胞被Epstein-Barr病毒激活阶段,或HIV直接激活B淋巴细胞。

三、促进AIDS发生的因素

HIV感染后,相当长时间内HIV在体内保持极低水平的复制,这就是AIDS无症状期持续时间很长。原因之一是由于细胞免疫和体液免疫可以降低调节病毒复制,原因之二是HIV进入CD4+t 淋巴细胞后,部分成为潜伏型。许多研究表明,一些细胞因子和其他病毒感染,能激活HIV的复制和表达,有报道认为糖皮质激素和白介素(IL-4,IL-6和IL-10等细胞因子)能协同增强HIV的复制。肿瘤坏死因子(TNF)α、β和IL-1亦能导致HIV的表达,其中特别是TNF-α。其他病毒的各种基因产物,能促进HIV高水平复制,而且有些病毒还能和HIV-1协同破坏CD4+t 淋巴细胞。所以在临床上AIDS患者常常合并感染巨细胞病毒,疱疹病毒,EB病毒,人类T淋巴细胞白血病病毒等,又并促使病情变化。

四、HIV感染后的免疫应答

人体的免疫系统是抗外部感染的最后防线,许多病源体感染人体,最后通过人体的细胞免疫和体液免疫而消灭,机体的免疫系统对HIV的初期感染起一定的抑制作用,但随着免疫系统的损害及HIV的变异,机体的免疫系统最终对HIV的感染无能为力。HIV感染能激发机体产生特异的细胞免疫反应和对各种病毒抗原产生相应抗体。机体产生T淋巴细胞介导的细胞毒作用,HIV感染者脑部有T淋巴细胞浸润。CD8+t 淋巴细胞对HIV病毒的抑制,溶解感染HIV的靶细胞,说明T细胞在HIV感染中发挥抑制HIV复制作用。机体产生的抗体可以中和游离HIV病毒及已和细胞结合的而尚未进入细胞内的HIV颗粒。自然杀伤细胞(NK)和杀伤细胞(K细胞)通过抗体依赖性细胞毒性作用能杀伤和溶解HIV感染的细胞。机体的细胞免疫和体液免疫作用可在一段时间内控制HIV的复制及扩散。但是,由于病毒的变异和重组,可以逃脱免疫监视,不能被机体的免疫系统彻底清除。当机体的免疫系统被进一步破坏时,在某些触发因素的作用下,使HIV大量复制和播散,最终导致AIDS的发生。

五、HIV感染与肿瘤

在HIV感染者中卡波济肉瘤,B细胞淋巴瘤何杰金病以及某些肿瘤发生率升高,和机体免疫功能破坏直接相关,但可能不是唯一的原因。当HIV感染者出现B细胞淋巴瘤时与EBV病毒感染有关,HIV并不能直接引起肿瘤,因在肿瘤细胞DNA内并不能证明有病毒序列存在。

HIV感染后的发病机理可归纳如下:①HIV侵入人体后首先与细胞表面含有CD4受体CD4+T淋巴细胞结合,进入细胞进行复制,部分整合于细胞染色体DNA中成为潜伏型;②机体细胞免疫和体液免疫对HIV的抵抗作用,使感染初期的HIV低水平复制;③在其他因素的作用下,潜伏的HIV被激活而大量复制,广泛侵入CD4+T淋巴细胞, 使CD4+T淋巴细胞、单核 — 巨噬细胞、B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞等功能受损,最后导致整个免疫功能缺陷,最终发生一系列顽固性机会感染和肿瘤的发生。

第五节 临床表现

HIV感染的临床表现分无症状的潜伏和严重的机会感染及肿瘤的临床症状。

一、无症状的潜伏期

从感染HIV2-12周后,多者6-8周,抗HIV抗体转为阳性,此时少数人呈现一过性急性感染症状,包括发热、皮疹、僵直、淋巴结肿大、关节痛、肌痛斑丘疹荨麻疹、腹痛、腹泄及个别病人出现无菌性脑膜炎,查白细胞正常,但单核细胞增多,淋巴细胞比例轻度降低,血小板轻度减少。其后持续呈无症状期,待细胞免疫功能低下时开始发病,无症状期可持续2-5年也有超过15年以上,大多数成人和青年感染HIV后,可长时间没有症状,但可检出病毒复制。随着免疫系统损伤,病毒不断增多,大多数感染了HIV的人才出现相关症状,如开始时出现倦怠感,发热持续不退,食欲不振和原因不明的体重减轻,继而出现腹泻盗汗、淋巴结肿胀(首先腋下、股部等)全身症状。当HIV侵犯中枢神经系统时,常出现痴呆健忘等症状。如果仅具有病毒抗体,而没有AIDS的特有的机会感染等症状时,称AIDS相关征候群(AIDS-related complex ,ARC)以及持续性全身淋巴结病(PGL)。

HIV感染后经过2-5年最终发展成AIDS者具有10%左右,ARc 30%左右,而无症状的HIV携带者占60%左右,从ARC发展成AIDS者占15%左右,所以大量患者为无症状的携带者。这就给AIDS的预防带来极大的困难。

HIV感染分类及AIDS诊断标准。

美国1993年修订的HIV感染分类系统及在青少年和成人中扩增监测艾滋病病例的诊断标准见表1

表1 美国1993年修订的HIV感染分类系统及AIDS诊断标准

CD+4T淋巴细胞分类临床分类
(A)(B)(C)
无症状的,急性(初期)HIV或持续的全身性淋巴结肿大有症状,但无A或C的情况有艾滋病指征
①≥500/μlA1B1C1
②200~499/μlA2B2C2
③<200μl(T细胞计数中的艾滋病指征)A3B3C3

该标准是根据HIV感染者的临床表现分成A、B、C三种,又用CD4+T淋巴细胞计数将每个临床类型分成三个等级,在上述3种临床分类中,除分类C全部属艾滋病例外,凡CD4+T淋巴细胞<200/μl,或CD4+t 淋巴细胞百分比<14%的HIV感染者(即A3,B3),也可归入艾滋病病例。

美国CDC1993年HIV感染分类系统和艾滋病诊断标准说明,见表2

表2 美国CDC1993年HIV感染分类系统和艾滋病诊断标准说明表

分类
(下述分类有前提,必须是HIV感染者)。
详细内容
分类A:凡是有下列三种情况之一者,即可归入A类:1.无症状的HIV感染者;
2.持续的全身性淋巴结肿大;
3.有急性(初期)HIV感染的疾病或病史者;
分类B 有下列11种情况之一者,归入B类1.杆菌引起的血管瘤病;
2.口咽部的念珠菌病鹅口疮);
3.持续、经常或治疗反应差的外阴阴道念珠菌病;
4.宫颈发育异常(轻度/严重)/宫颈原位癌;
5.持续一个月以上的全身性症状,如发热(38.5℃)或腹泻。
6.口腔有毛状粘膜白斑病;
7.包括至少二次明显的突发或一处以上皮区的带状疱疹
8.特发的血小板减少性紫癜
9.李司忒菌病;
10.盆腔炎症状性疾病,特别是并发输卵管、卵巢脓肿
11.周围神经病。
分类C 包括25种艾滋病指征疾病,凡有其中之一者,不论CD+4T淋巴细胞数高低,即可诊断为艾滋病1.支气管、气管或肺的念珠菌病;
2.食道念珠菌病;
3.侵袭性宫颈癌
4.弥漫性或肺外的球孢子菌病
5.肺外的隐球菌病
6.引起慢性肠炎(病程>1个月),的隐孢子虫病
7.除肝、脾、淋巴结外的巨细胞病毒性疾病;
8.导致失明的巨细胞病毒性视网膜炎
9.HIV相关性脑病;
10.单纯疱疹引起的慢性溃疡(病程>1个月),或支气管、肺炎和食管炎;
11.弥漫性或肺外的组织胞浆菌病
12.等孢子虫病引起的慢性肠炎(病程>1个月);
13.卡波济肉瘤;
14.伯基特淋巴瘤;
15.免疫母细胞淋巴瘤;
16.脑的原发淋巴瘤;
17.弥漫性或肺外鸟型结核分支杆菌复合症或堪萨斯分支杆菌;
18.任何部位(肺部或肺外的)结核分支杆菌;
19.弥漫性或肺外其他种别或未鉴定种别的分支杆菌;
20.卡氏肺囊虫肺炎
21.反复发作的肺炎;
22.进行性多病灶脑白质病;
23.反复发作的沙门菌败血症
24.脑弓形虫病
25. 由HIV引起的消瘦综合症。

典型艾滋病有三个基本特点:①严重的细胞免疫缺陷,特别是CD4T淋巴细胞缺陷;②发生各种致命性机会感染(opportunistic infection)特别是卡氏肺囊虫肺炎(Pneumocystis Carini pneumonia 简称PCP);③发生各种恶性肿瘤,特别是卡波济肉瘤(Kaposis sarcoma,简称KS)。艾滋病患者发生PCP的占64%,同性恋及非洲艾滋病例中KS发生率较高。AIDS病人同时发生PCP和KS死亡率最高。

二、艾滋病患者常见的机会感染:

(一)病毒性感染症

1.巨细胞病毒感染是一种少见病,但在AIDS患者中约占90%,是AIDS常见的并发症,也是AIDS患者致死的一个重要的合并症。感染可累及肺、消化道、肝及中枢神经系统和多个脏器,约有1/3患者合并网膜炎,临床症状为发烧、呼吸急促发绀呼吸困难等,胸部X线照片多出现间质性肺炎的改变,双肺野可见弥漫性的毛玻璃或网状小颗粒状阴影,晚期因肺泡腔中分泌物贮留而发展为肺泡改变,AIDS患者对巨细胞病毒的抗体效价升高。

2.单纯疱疹病毒感染症:单纯疱疹病毒(Herpes Simplox Virus,HSV)引起的感染症与CD4T淋巴细胞数有关,在口唇、阴部、肛周处形成溃疡病变、疱疹性瘭疽(广泛皮肤糜烂)等难治病变,疼痛明显,也可以见到疱疹性肺炎,消化道及疱疹性脑炎。血清学方面诊断意义不大,可用基因诊断方法确诊。治疗选用无环鸟苷静滴。

3.带状疱疹(Herps zoster)本症是由水痘——带状疱疹病毒(Varicella-Zoster virus,VZV)引起,在美国50岁以下的患带状疱疹者应怀疑有HIV感染的可能。非洲多数患者呈现颜面带状疱疹以至发展网膜坏死。治疗同单纯疱疹病。

(二)细菌性感染

1.非典型抗酸菌症:AIDS患者并发细菌感染,多为分枝杆菌所致的全身感染。本病无自觉症状,在临床上也没有特异性的表现,有些病人出现盗汗、高热、全身衰弱、腹泻、腹痛、吸收不良等消化系统症状。此外还可见到贫血、体重下降。诊断主要靠血液培养。治疗多用抗结核药物,但常常有耐药性。由于该感染不会危及生命,所以可采取消炎、解热镇痛剂及加强营养等对症疗法。

2.结核病,AIDS患者常常发生结核病的复发。以肺外重症全身感染多见,胸X片多为正常,由于AIDS患者免疫系统受到破坏,所以结核菌素反应多为阴性。因多为全身感染,故在粪便、血液、尿、痰以及淋巴结、肺、肝、胃肠粘膜、骨髓等活检标本的涂片,培养均有结核菌的存在,在诊断上意义较大。治疗可用抗结核药物。由于结核菌可以通过飞沫感染等方式向健康人扩散,对可疑并发结核病的AIDS患者应服用雷米封预防。

(三)深部真菌感染

1.念珠菌病(Candidiasis)念珠菌感染是机会真菌症中最常见的一种。在AIDS中显得优为突出,除了合并皮肤、口腔浅部念珠菌感染外,还可引起食道念珠菌病。可出现体重减少,倦怠感,非特异的消化系统症状主要有咽下困难,胸骨后疼痛。诊断可进行白色念珠菌分离。AIDS早期诊断依据中,本症占很重要的位置。治疗,采用抗真菌剂,可使症状好转,但易再发,显示难治性。

2.隐球菌病(Cryptococcosis)AIDS患者合并隐球菌病的发病率为6%,以脑脊髓膜炎最为多见,亦可合并肺隐球菌病或隐球菌心外膜炎,临床上主要表现为发热、头痛、倦怠感、羞明、精神状态变化、痉挛等症状。脑脊液检查在诊断上很重要,蛋白、细胞数增加,髓压升高,糖减少等。

(四)原虫、寄生虫侵染。

卡氏肺孢子虫性肺炎(Pneumocytsis carinii pneumonia PCP卡氏肺炎):卡氏肺孢子虫是众所周知的典型的机会感染的病原体之一,一般在健康人的肺泡中也有寄生,但多为不显性,也是人畜共患的一种疾病,当其宿主免疫功能受某种原因使其减退时得以繁殖及发挥其病原性,在AIDS中由于免疫系统受到损害,而导致卡氏肺孢子虫肺炎的发生。

卡氏肺包子虫肺炎是非常重要的机会感染症,在初发AIDS时有60%并发此症,全病程中将有80%-85%合并本症。初期症状由于低氧血症出现进行性呼吸障碍为特征,特别是劳动时出现气喘、呼吸困难、干性咳嗽、发热等自觉症状。

胸X片所见,多为非特异的浸润阴影,5%显示正常。咳痰粘稠,确诊需检出卡氏肺孢子虫,取材时先洗净支气管肺泡,经支气管取材或开胸取肺组织活检。

关于ADIS并发卡氏肺炎与非AIDS并发卡氏肺炎,在临床上有所不同,见表3。

表3  AIDS合并卡氏肺孢子虫肺炎与非AIDS合并卡氏肺孢子虫肺炎的不同点

项目AIDS并PCP非AIDS并PCP
流行病学发病率高
美国占60%~64%
日本占半数
发病率低
CDC:0.01~1.1%
Stjode C.R.H22%~42%
日本京都医大儿科30.6%
前驱症状潜伏期长(1~27日平均28日)比较短(1~15日平均5日)
临床症状比较缓慢症状长时间持续、发热、PaO2,x-p等稍缓慢发病急
症状急剧
治疗效果约两周以上约1~2周以内
ST合剂的副作用发疹等副作用频发发病率64.7%副作用轻微者多发病率11.8.%
死亡率一次发病到死亡约占50%20%~50%
再发率高(约20%)低(成人基本0%,小儿占11.8%)
病理组织象的改善表现延迟多经治疗,早期改善
P.C的残留长期残留者多由于治疗,显著减少
全身播散可能性多(?)少(?)

治疗:复方新诺明为首选药物,其有效率与AIDS以外的其他免疫缺陷患者几乎相同,约占50%~60%,但该药引起的药物性发热、皮疹、白血球、血小板减少、肝功能障碍等副作用的发生率较高,在不经治疗情况下,几乎100%死亡。

AIDS患者还可并发类似于孢子虫病。如阿米巴病,毒浆体原虫病,隐性孢子虫病。

三、艾滋病患者与肿瘤

AIDS基于免疫功能缺陷导致肿瘤发生成为AIDS主要的致死原因之一,1986年曾在日本长畸召开“Kaposis肉瘤(KS)”及“AIDS”国际研究会中确认AIDS并发KS与原始的KS有所不同,故AIDS与肿瘤的关联性引起关注。

(一)Kaposis肉瘤(Kaposis Sarcoma,KS)

KS是AIDS恶性肿瘤的代表病种,KS于1872年由Kaposis首先报道,他根据3例患者的观察结果,描述了KS的临床特点,以皮肤特发性,多发性,色素性肉瘤。认为是非洲大陆赤道地区一种地方多发病,在当地地理条件下,主要侵犯中老年男性,在四肢发生多数的大小不同的结节,后人称此病为Kaposis肉瘤。

1.Kaposis 肉瘤形成因素。

KS的形成因素目前尚不清楚,AIDS并发KS的原因,诱因以及与其关联性有以下思考:

(1)  AIDS中约30%并发KS,此AIDS流行病型KS有90%为男性同性恋者,从地理病毒学病态象上分析原因,目前还不能明确有什么直接关联,从学术角度观察,感染AIDS病毒时可见单核细胞血管增殖性因子,有人认为此因子是发生KS的重要因素。1995年曾有学者对KS细胞的增殖因子有过记述,用KS细胞进行长期培养在活性化的CD4阳性T细胞的培养上清中证明对KS细胞有剧烈的增殖,促进活性作用。

(2)  免疫缺陷状态,免疫缺陷发生KS是AIDS发病的重要症状之一。免疫缺陷与KS发病之间存在着密切的关系,如肾移植时在治疗中进行人工的免疫抑制状态时或在麻风病人等并发KS。在免疫抑制剂疗法停止后可自然消退。AIDS患者免疫缺陷而KS发生较多见。

(3)CMV:AIDS并发KS病例,检出巨细胞病毒(CMV)约80%以上,是否该病毒与KS发生有关系?最近,日本一学者从KS病人血清中检出CMV抗体,用荧光抗体法检出异型细胞的核及胞体内有与CMV有关的抗原。

(4)EBV:EBV与KS的关系用间接方法对一非洲型淋巴细胞瘤及KS进行检测,认为与地理病理学有关系,并指出EBV与KS关系是今后值得研究的课题。

2.Kaposis肉瘤临床症状。

KS侵犯的部位很广泛,四肢、颜面以及躯干等处,皮肤均可出现,口腔粘膜、眼睑、粘膜处也有发生。此外,肺、肝、脾等脏器,尤其是消化道发生时易出现大出血危险。总之,KS可在全身各处发生,其临床表现:

①结节型:樱桃红色或紫色,表面平滑,突出皮肤表面,境界清楚,质较硬。压迫可使其体积缩小,放松后10秒内恢复原状。此征称为Hayne氏征,结节可分布于全身各处,但以双下肢、脚和前臂等处最常见。典型的病灶易出血,但无疼痛,病人多为年长者。病后存活期10年左右。

②浸润型,皮损互相融合,溃疡或状增生,常累及皮下和骨组织,此型多发生于下肢和足部,皮损中有结节存在。该型进展快,存活期不超过3年。

③泛发型:是指除皮损外病变广泛侵及内脏器官组织,如胃肠道、肝、脾、呼吸道和淋巴组织等。淋巴组织被侵犯时,可称淋巴腺样Kaposis肉瘤。泛发型虽然只占全部病例的5%左右,但病情发展快,预后不良,常因大出血而危及生命。

KS肉瘤患者常有营养不良,儿童病人可有皮肤粗糙征,肠原性肢端皮炎,坏血病样皮损及重症口疮等。还有50%的病人伴有甲黄症。

3. KS病理改变。

肿瘤结节是由梭形细胞和小血管组成,而且血管高度扩张,管壁变薄,细胞增殖与梭形内皮细胞浸润,梭形细胞分化较好,细胞排列紧密呈编织状,细胞间纤维组织丰富。小血管为毛细血管和血窦,并可见有一些以梭形细胞为界,充满红细胞的裂隙。小血管呈零散或片状分布在梭形细胞之间,二者紧密结合。这种损害在真皮的中下层,向外可向表皮侵犯形成溃疡,内可侵犯骨质。结节中有时可见到出血及含铁血黄素沉着。周围可有小淋巴管扩张,淋巴细胞浸润,浆细胞反应及肉芽增生现象,形状很不规则。有时还可发现有淋巴管肉瘤、血管外皮瘤及微小Kaposis肉瘤内多发的血管球瘤等改变。

4. KS治疗:AIDS相关型KS治疗较传统的KS困难。

(1)联合治疗

长春花碱(Vinblastine)对AIDS的KS有明显疗效,开始剂量4mg,生理盐水或5%葡萄糖20-30ml静脉注射,在维持白细胞在2.5-3×109/L的情况下,渐增至每次9mg,每周一次,6-8周。

② 春新碱(Vincristine)与长春花硷相似,对AIDS的KS有一定疗效,1.4-2.0mg/次,用生理盐水20-30ml静脉注射,每周一次。

③ 足叶乙甙(etoposide vepesid, VP-16)是治疗AIDS的有效药物。

④ 博来霉素,阿霉素。

(2)放射疗法,可缓解症状,有效剂量1800-3000rad。

(3)局部液氮冷冻。

(4)免疫调节剂:干扰素、异丙肌苷、胸腺素、白细胞介素等。

(二)淋巴瘤

HIV感染出现非何杰金淋巴瘤是诊断AIDS的一个指标。AIDS患者中大约有5%-10%的人可能发生非何杰金淋巴瘤,其中包括脑的原发性细胞淋巴瘤。大部分患者为分化不良型的淋巴瘤,包括小分裂细胞型和大细胞免疫母细胞型,这些病人常出现淋巴结外病变,并常侵犯骨髓,中枢神经系统和胃肠道、肝、皮肤和粘膜等部位,大多数患者表现淋巴结迅速肿大,淋巴结外肿块,或出现严重的发热、盗汗、体重减轻,有些患者常出现原发于中枢神经系统的淋巴瘤。

第六节 诊断

一、诊断依据:

(一)流行病学及临床表现

(二) 实验室检查

(1)主要是中度以上细胞免疫缺陷包括:CD4+T 淋巴细胞耗竭:T淋巴细胞功能下降,外周血淋巴细胞显着减少,CD4<200/μl,CD4/CD8<1.0,(正常人为1.25~2.1),迟发型变态反应皮试阴性,有丝分裂原刺激反应低下。

(2)B淋巴细胞功能失调:多克隆性高球蛋白血症,循环免疫复合物形成和自身抗体形成。

(3)NK细胞活性下降

(4)各种致病性感染的病原体检查如PCR。组织学证实的恶性肿瘤,如KS;

(三)HIV抗体检测

1.酶联免疫吸附法(ELISA);2.明胶颗粒凝集试验(PA);3.免疫荧光检测法(IFA);4.免疫印迹检测法(Western Blot,简称WB法);5.放射免疫沉淀法(RIP)。其中前三项常用于筛选试验,后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体,95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者,此时有必要检测HIV病毒。

(四)PCR技术检测HIV病毒

1.标本的采集与模板核酸的制备。从怀疑为AIDS和ARC患者以及无症状的同性恋者采集血液标本,分成两份,其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20~-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚蔗糖(Ficoll)离心分离,收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的新生儿的血液标本。

可采用下述方法自血液标本中分离外周血单核细胞(PMC):

① 取4ml血液用Hanks液1:1稀释。

② 向含有1份淋巴细胞分离液的试管内轻轻加入两分稀释的血液,勿搅乱分层。

③ 2500r/min离心20min。

④ 吸出介于淋巴细胞分散液和血浆层间的PMC层,再用Hanks液洗两遍。

⑤ 加入RPMI-1640生长液(10%胎牛血清,10%白介素-2,2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血凝集素P),使细胞浓度为2×106/ml。

⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2~3d,作为HIV分离的靶细胞。

2.模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法,但其基本原理大致相同,使用的试剂因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取DNA和RNA的方法。

(1)从外周血单核细胞中提取DNA

方法A:

①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小离心管内。

②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。

③2500r/min离心10min,弃上清。

④沉淀的细胞用PBS洗两次,最后将细胞悬浮在溶液A(100mmol/KCl,10mmol/LTris-HCl,pH8.3)中,使细胞浓度为6×106/ml。

⑤加入等体积的溶液B(10mmol/LTris-HCl,pH8.3,2.5mmol/l MgCl2,10%Tween20,10%NP-40)。

⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。

该方法也适用于无Glyciegel保存的肝素标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。

方法B:

①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。

②2500r/min离心10min,收集沉淀的细胞,上清液可作血清学研究用。

③用10ml0.9%NaCl(含50%葡萄糖)将沉淀的细胞洗一次。

④再用10ml 0.9%NaCl(含50%葡萄糖)洗两次。

⑤通过聚蔗糖-400离心,分离单核细胞。

⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解缓冲液(10mmol/L,Tris-HCl pH8.3,10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,0.5%SDS,100μg/ml蛋白酶K)中使细胞裂解。

⑦用酚一氯仿抽提两次,将水相转移到一支新的离心管内。

⑧加入3倍体积的无水乙醇,于-20℃放置20min,13000r/min离心10min,弃上清,沉淀物经真空干燥后,用100μl蒸H2O溶解,于-20℃保存。

该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。

(2)从外周血单核细胞中提取RNA及其反转录

方法A:

① 5ml血液标本,通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。

② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。

③ 2500r/min离心20min,收集沉积细胞。

④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液(0.4mmol/L NaCl,10mmol/l Tris-HCl,pH8.3,1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40)中,使细胞浓度为104/ml。

⑤ 13000r/min,于4℃离心10min,收集上清液。

⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内,立即置-80℃保存,备用。

在RNA反转录前,先将RNA样品用DNase处理,除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR扩增。RNA反转录操作如(7)~(9)。

⑦ 取10μlRNA样品加2.7UDNase I。

⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。

⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品,加入RNase A(15μg/份),37℃保温10min,置-20℃保存。

方法B:

①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。

②40000r/min,4℃离心10min,收集沉淀。

③将沉淀物溶于变性液(4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基乙醇)中充分混匀.

④加入30μl2mmol/L乙酸钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异戊醇混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min.

⑤13000r/min离心20min.

⑥轻轻将水相转移到一支新管中.

⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右.

⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀.

⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,真空干燥.

⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录.

⑾ 取10μl RNA样品.

⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/LNaCl,10mmol/L Tris - HCl,pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV逆转录酶。

⒀ 42℃保温30~60min,然后93℃5min.

⒁ 立即置冰浴中冷却,备用。

由上述方法制得的RNA反转录样品,通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳可鉴定其特异性。

二、PCR扩增步骤

(一)引物的设计与合成

HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV基因易发生变异,因而引物应在保守区内设计,一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计,HIV感染的细胞往往很少,要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞,PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力,同时一般要采用巢式-PCR方法,来提高检测的灵敏性。

检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感细胞混合得到连续的10倍感染细胞的稀释液。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它逆转录病毒感染细胞的DNA作对照,进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析,进一步确定扩增产物的特异性。

已经被确定的保守区是gag,tat,evn,pol基因中的某些核苷酸序列。在用于临床标本检测之前,要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV基因组序列的质粒DNA稀释液和2μg载体鲱鱼精DNA。如引物是特异的,它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板,就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段,那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进,看是否能改善其特异性,否则要另选引物。

表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及探针

引物及探针序列(5′3′)基 因区片段(bp)
SK38ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAATgag115(HIV1)
SK39TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC
SK19(P)ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC
SK145AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAATgag141(HIV1)
SK101GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC139(HIV2)
SK102(P)GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
SK145AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAATgag142(HIV1)
SK150TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC139(HIV2)
SK102(P)GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT
O-1GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACgag525(HIV1)
O-2TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC
I-2TTGGTCCTTGTCTTATGTCCgag422(HIV1)
I-1TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC
GK55CCTGCTATGTCACTTCCCCTgag190(HIV1)
GK56TTATCAGAAGGAGCCACCCC
P-1TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCATpol355(HIV1)
P-2TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA
SK29ACTAGGGAACCCACTGCTItr105(HIV1)
SK30GGTCTGAGGGATCTCTA
SK31(P)ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT
P13TGGCGCCCGAACAGGGACLTR168
P14TACCCACGCTCTCGCAG
SK89AGGAGCTGGTGGGGAACGLTR165(HIV2)
SK90GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA
SK91(P)TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG
SK68AGCAGCAGGAAGCACTATGGenv142(HIV1)
SK69CCAGACTGTGAGTTGCAACAG
SK70(P)ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT
CO1ACAATTATTGTCTGGTATAGenv135(HIV1)
CO2AGGTATCTTTCCACAGGCAG
CO3(P)TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG
CO71TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAAenv320(HIV1)
CO72TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT
CO75(P)GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA

(二)PCR扩增步骤

1.扩增条件

当选择的引物影响其特异性和扩增效果时,首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度,PCR循环数,反应物浓度等。扩增的条件通常是1~4mmol/LMgCl2,0.5~1.0mmol/ldNTP,每100μl反应体积2~4U Taq DNA聚合酶,2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25~30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37~55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。

2.扩增的步骤

(1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA样品。

(2)用10μl 1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl,2mmol/L MgCl2,16mmol/LDTT)。

(3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。

(4)反应混合物于93℃变性处理7min。

(5)冷却至室温,加入4UTaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。

(6)加入50μl矿物油,离心10s。

(7)置70℃保温5min。

(8)PCR扩增25个循环,95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。

PCR检测出现假阴性的原因有:标本中的HIV-DNA量极少,未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平;DNA模板和PCR产物未能完全变性,使得引物不能或较少与DNA片段结合,从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异,也会出现假阴性。PCR假阳性的原因主要有:标本的交叉污染;重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照,阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液,阳性对照用已知的HIV-DNA。

三、扩增产物的检测和分析

扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳,限制性内切酶图谱,DNA序列分析及分子杂交等技术。

(一)凝胶电泳分析

根据所采用的引物对之间DNA片段的长度,预计PCR产物的分子大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较,可初步判断PCR产物的特异性,然后将产物用限制性内切酶水解,进一步确定扩增产物的特异性。

(二)分子杂交分析

分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法,也是检测扩增产物的非限制性内切酶位点上碱基突变的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针与PCR产物进行分子杂交,检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下:

PCR扩增技术和分子杂交的敏感性。

PCR技术检测HIV具有敏感性高,特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB染色的电泳凝胶来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。

四、PCR技术在HIV检测中的应用

PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和病毒学标志出现前检测病毒序列,这样可判定无症状而且血清阴性患者潜在的HIV的传播性;可用来监测长潜伏期(4~7年)病人,以及在抗病毒治疗期间病毒的水平;也可用于HIV-1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测。在婴儿出生后最初的6~9个月期间,他们的血液中存在母体的抗体,因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。

(一)血清抗体阳性病人HIV序列的检测

有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞培养物,精液细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI消化。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明,在逆转录酶阴性的28个细胞系中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多细胞培养物认为是阴性者,实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。

从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA,用PCR可100%检出病毒序列;用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本,经PCR扩增检出病毒序列者为64%,血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性,表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的异源性,为提高检测的阳性率可采用多种引物(如LTR,gag和env基因的引物)。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性(99%)。

(二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测

由于在感染HIV后到出现免疫反应之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在高危人群中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月.对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24~39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。

(三)新生儿HIV序列的检测

HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%~60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30~50%的这些新生儿可在母亲的子宫里,在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何症状.病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药毒性大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12~15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的.

PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群,如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿,阳性患者的性伴侣,静脉吸毒者和可疑的血清反应者。PCR技术还可用来检测血液制品及疫苗中有无HIV。

五、艾滋病诊断标准:

1.艾滋病病毒抗体阳性,又具有下述任何一项者,可为实验确诊艾滋病病人。

(1)近期内(3-6个月)体重减轻10%以上,且持续发热达38℃一个月以上;

(2)近期内(3-6个月)体重减轻10%以上,且持续腹泻(每日达3-5次)一个月以上。

(3)卡氏肺囊虫肺炎(PCR)

(4)卡波济肉瘤KS。

(5)明显的霉菌或其他条件致病感染。

2.若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时,可为实验确诊艾滋病病人。

(1)CD4/CD8(辅助/抑制)淋巴细胞计数比值<1,CD4细胞计数下降;

(2)全身淋巴结肿大;

(3)明显的中枢神经系统占位性病变的症状和体征,出现痴呆,辩别能力丧失,或运动神经功能障碍。

第七节 鉴别诊断

需与下列疾病进行鉴别:

一、原发性免疫缺陷病

二、 继发性免疫缺陷病,皮质激素,化疗,放疗后引起或恶性肿瘤等继发免疫疾病。

三、特发性CD4+T淋巴细胞减少症,酷似AIDS,但无HIV感染。

四、自身免疫性疾病:结缔组织病,血液病等,AIDS有发热、消瘦则需与上述疾病鉴别。

五、淋巴结肿大疾病:如KS,何杰金病,淋巴瘤,血液病。

六、假性艾滋病综合征:AIDS恐怖症,英国同性恋中见到一些与艾滋病早期症状类似的神经症状群。

七、中枢神经系统疾病:脑损害可以是艾滋病或其他原因引起的,需予鉴别。

第八节 病程与预后

自感染至症状出现经过的时间不断延长,这可能与诊断技术提高,患者发现越来越早有关。报道的无症生存期越来越长,最初估计成人的潜伏期约为8~10年,而5岁以下儿童一般在两年内出现症状。历来对同性恋及异性恋男性的研究表明,约半数人在开始感染HIV后10年未发生AIDS,并且,其中一项研究发现,感染的男性中8%的人在10-15年均正常。伦敦皇家医院报道一项大规模的调查结果,无症生存可达20年至25年。最近也有人认为实际上所有感染者最终将出现AIDS的表现。因此,当有感染的指征时,应即时应用治疗,预防机会性感染发生,如出现机会感染和肿瘤则应给予相应的治疗。

AIDS患者存活时间在逐渐延长,不同地区调查的不完全相同,存活时间的长短与卫生保健水平、感染时间、最初诊断疾病有关,最重要的是早期诊断能延长病人存活时间。树立战胜疾病的信心,保持乐观的人生观,对于延长存活时间也起着重要的作用。

第九节 治疗

由于目前对病毒感染性疾病没有特效的治疗药物,所以对AIDS也没有有效的治疗办法。加之,HIV病毒核酸与宿主染色体DNA整合,利用宿主细胞进行复制,给药物治疗带来了困难。HIV感染的早期治疗十分重要。通过治疗可减缓免疫功能的衰退。HIV感染者患结核、细菌性肺炎和卡氏肺囊虫肺炎的危险性增加,进行早期预防十分重要。

一、支持疗法、尽可能改善AIDS患者的进行性消耗。

二、免疫调节剂治疗:

(一)白细胞介素2(IL-2):提高机体对HIV感染细胞的MHC限制的细胞毒性作用,亦提高非MHC限制的自然杀伤细胞(NK)及淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的活性。

(二)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF):增加循环中性粒细胞,提高机体的抗感染能力。

(三)灵杆菌素:激活脑下垂体——肾上腺皮质系统,调整机体内部环境与功能,增强机体对外界环境变化的适应能力,刺激机体产生体液抗体,使白细胞总数增加,吞噬功能加强,激活机体防御系统抗御病原微生物及病毒的侵袭。

(四)干扰素(IFN):α-干扰素(IFN-α),对部分病人可略提高CD4+T细胞,40%Kaposis肉瘤患者有瘤体消退;②β-干扰素(IFN-β):静脉给药效果与IFN-α类似,但皮下注射,抗Kaposis肉瘤作用较弱;③γ-干扰素(IFN-γ)提高单核细胞—巨噬细胞活性,抗弓形体等条件性感染可能有一定效果。

三、 抗病毒制剂:

(一)抑制HIV与宿主细胞结合及穿入的药物:可溶性rsCD4能与HIV结合,占据CD4结合部位,使HIVgp120不能与CD4T淋巴细胞上的CD4结合,不能穿入感染CD4T淋巴细胞。

剂量:rsCD4临床试验30mg/日,肌注或静注,连续28天。

(二)抑制HIV逆转录酶(RT)的药物:通过抑制逆转录酶,阻断HIV复制。效果较好的药物有:叠氮胸苷、双脱氧胞苷。

第十节 预防

一、特异性预防

(一) 随着1993年美国CDC分类诊断标准,扩大了AIDS的诊断范围,有利于AIDS的预防及治疗,依据CD4T淋巴细胞减少,给予一定的投药。

(二) 艾滋病疫苗:美国对含有gp120成份的两种艾滋病疫苗进行了第二期296人的试验,由于已有6人发生了感染,而暂时终止。泰国正进行UBI合成疫苗试验。

(三) 阻断母婴传播:CD4+T淋巴细胞>200/μl的艾滋病孕妇,用AIT于产前,产程内及婴儿治疗,有一定的保护效果。

二、综合预防

(一)普及宣传艾滋病的预防知识,了解传播途径和临床表现及预防方法;

(二)加强道德教育,禁止滥交,尤其与外籍人员性乱行为,取缔暗娼;

(三) 避免与HIV感染者、艾滋病病人及高危人群发生性接触;

(四)禁止与静脉药隐者共用注射器、针头;

(五)使用进口血液,血液成份及血液制品时,必须进行HIV检测;

(六)国内供血者严格排选,应逐步做到检测HIV阴性方能供血,严防HIV传播;

(七)献血、献器官、组织及精液者应做HIV检测;

(八) 建立艾滋病检测中心;

(九) 提倡使用避孕套和避免肛交;

(十) 艾滋病或HIV感染者应避免妊娠,出生婴儿应避免母乳喂养。

下载《基因诊断与性传播疾病》 电子书打不开?

下载所有中医书籍

杂集相关医书