基因工程生产降钙素研究方兴未艾

  自1975年开始被用于治疗原发性骨质疏松症、高血钙症、变形性骨炎,缓解急性粉碎性骨折所致的炎症水肿和剧痛等,降钙素一直被临床广泛应用。降钙素的生产方法主要有提取法、化学合成法和基因工程法。提取法由于天然原料含量极微、提取工艺复杂,化学法合成法由于成本较高等原因,限制了它们的使用和推广。

  近年来出现的用基因工程法对降钙素基因进行改造、重组及大规模生产具有重要的现实意义。20世纪90年代末,我国开始了基因工程降钙素的研究,取得了一些积极进展。

  大肠杆菌表达系统我国学者在大肠杆菌中表达了融合蛋白形式的鲑鱼及人降钙素,再从融合蛋白中切下羧基末端为甘氨酸的降钙素前体,经肽酰甘氨酸酰化单氧酶的作用,加工成为成熟的降钙素。

  大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统。它具有生长快速、生长周期短、培养条件简单、安全性好、价格低廉、可以高效表达外源蛋白、适合不同的基因产物、易于进行工厂化批量生产等优点,是人们克隆与表达外源基因的首选菌株。

  然而这一方法也存在一定局限。用大肠杆菌表达降钙素最大的问题是C-末端32位脯氨酰胺不能酰胺化,表达的降钙素活性低,需要进行体外酰胺化提高活性,而且高效表达需不同异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导,使得生产成本大大增加。另外,大肠杆菌表达的蛋白质多数是包涵体,包涵体变性后复性条件的优化和复性效率也是一个难题。

  乳酸杆菌表达系统乳酸杆菌是一种常见的益生菌,作为外源蛋白表达系统,它具有很多优势,如无致病性、在人和动物体内占绝对优势,使外源蛋白可能达到较高表达量等等。虽然有人对乳酸杆菌表达载体表达鲑鱼降钙素在实验室中进行了尝试,并获得了成功,但目前对用乳酸杆菌表达降钙素的研究很少。究其原因可能与以下几个原因有关。

  一是乳酸杆菌遗传背景不清楚,它的质粒大多是隐蔽型的,因此对乳酸杆菌基因转录和翻译的调控及蛋白质分泌的机制了解较少。二是直接饲喂重组的乳酸杆菌并不能在体内表达足够的抗原量。三是长期低剂量的刺激可能导致机体免疫耐受。四是口服重组乳酸杆菌可能只对局部病变有较好的预防效果。乳酸杆菌也属于原核表达系统,没有真核翻译后加工的功能,表达的降钙素不能酰胺化,活性较低,必须进行后加工。

  尽管如此,乳酸杆菌表达系统仍具有巨大的开发潜力。首先,乳酸杆菌像食物和水一样可以直接口服,正是良好的口服疫苗载体。其次,乳酸杆菌不仅对机体无毒无害,而且它自身及其各种代谢产物对机体也有营养和免疫的功能,再加上其携带的目的蛋白的专一性作用,可以说是集多种功能于一身,正属于现在最倡导的多功能微生态制剂。随着基因工程技术的发展,乳酸杆菌的研究会日益清楚,重组乳酸杆菌基因工程菌的时代必将到来,并将在未来食品和医药工业领域得到更广泛的应用。

  酵母表达系统酵母是生产真核异源蛋白的宿主菌,既具有原核表达系统生长迅速、操作简单、价格便宜、安全性好、遗传背景清楚等优点。目前用于表达降钙素的主要是毕赤酵母。我国学者曾报道在毕赤酵母中表达了鲑鱼降钙素与骨生长肽(OGP)融合蛋白,细胞实验(体外)和动物实验(体内)结果都证明表达的融合蛋白既可以抑制破骨细胞的活性,又可以促进成骨细胞的活性。

  虽然降钙素在毕赤酵母中表达获得了成功,但应该看到酵母表达系统仍存在局限性。首先,分泌表达产物存在不均一性,出现如信号肽加工不完全,表达产物在培养基中被自身分泌的蛋白酶降解等现象;其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中乙醇氧化酶1(AOX1)基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低,从而大大延长了细胞培养发酵时间,长时间的发酵不利于外源蛋白的表达;第三,利用易燃的甲醇做原料,表达产物的卫生安全性需要考虑;第四,筛选药物价格昂贵也给生产应用带来局限。重要的是毕赤酵母不能使蛋白酰胺化,故用酵母系统生产降钙素活性不是很高,而且产品,不利于表达产物应用于人体。

  昆虫杆状病毒系统近年来,以昆虫杆状病毒作为表达载体已越来越受到人们的注意,用这种杆状病毒为载体表达的外源基因已很多。其优越性主要包括杆状病毒对于脊椎动物和其他昆虫细胞是安全的、在强有力的多角体蛋白启动子转录控制下,外源基因表达的水平高等。

  但是,也应该看到,昆虫杆状病毒系统虽然以高表达著称,然而不同外源基因产物的表达水平相差很大,实际表达水平可能受到很多因素的影响;传统的昆虫细胞内的重组方式步骤繁琐、费时,获得重组体的概率为0.1%~1.0%,且重组病毒的鉴定不易准确;杆状病毒表达系统的外源蛋白只有少部分是分泌性的,而大部分是非分泌性的,不利于蛋白收集和分离;在病毒感染晚期,由于大量外源蛋白的表达,可引起宿主细胞的裂解,细胞裂解后,胞质内的物质释放出来,使重组蛋白的纯化很困难,水解酶的释放可降解重组蛋白。

  植物表达系统用植物表达系统生产降钙素的主要方法是降钙素在转基因植物中的表达。这种植物生物反应器与其他生物反应器如细菌、酵母相比,优点在于生产成本低、能准确地进行翻译后加工,克服了原核表达系统不能完成蛋白翻译后修饰的缺点、无病原污染等优点。然而,由于外源基因DNA的甲基化、基因共抑制效应等原因,转基因植物的表达效率不稳定,影响了转基因植物实现产业化。而且,这种方法中目标蛋白与植物内源蛋白难于分离,纯化费用高。

  值得一提的是,近年来出现了用植物油体表达体系生产降钙素的方法。植物油体表达体系是将外源基因插入油体蛋白的N端或C端,构成融合蛋白,融合蛋白在转基因植物种子中特异表达,并镶嵌在油体表面。因此利用油体亲脂疏水的特性,将转基因植物种子经粉碎-液体抽提-离心处理,回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开,可去除质量分数90%以上的种子蛋白。沈阳农业大学植物保护学院进行的建立油菜油体表达体系表达医用蛋白鲑鱼降钙素的研究已通过成果鉴定。