重视β-内酰胺类抗生素高分子杂质研究

　　近年来研究发现，同一品种不同厂家的产品、同一品种不同批号的产品，有的易发生过敏反应，有的则不易发生过敏反应。也就是说，药物的质量直接影响着过敏反应的发生率。研究表明，过敏反应的发生率与药品中高分子杂质的含量密切：相关高分子杂质的含量越低，过敏反应的发生率也就越低；高分子杂质的含量越高，过敏反应的发生率也就越高。

　　■高分子杂质是主要过敏原

　　目前，我国科研人员经过深入的研究，已从头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、头孢他啶等四种第三代头孢菌素中分离收集到了能引发动物过敏反应的基本无抗菌活性的聚合物。利用动物口服主动过敏反应模型，确证引发青霉素V钾、阿莫西林等口服青霉素过敏反应的主要过敏原是它们的高分子杂质，而头孢菌素和青霉素本身并不引发过敏反应，肠道吸收不会影响其过敏特性。因此，在研制生产β-内酰胺类抗生素过程中，必须对其中的高分子杂质进行研究，以指导优化制备工艺、确定适宜的贮藏条件和使用方法，并严格控制其含量，以减少临床过敏反应的发生。随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。

　　■凝胶色谱法具明显优势

　　高分子杂质的分离分析方法主要有：反相色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法（分子排阻色谱法）。由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（过敏性），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。因此，根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法则具有明显的优势。

　　凝胶色谱法（分子排阻色谱法）是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。药物分子进入凝胶孔径内部，而高分子杂质则被排阻在外，在色谱过程中不被保留，最早被洗脱出来，保留时间较短，而药物被保留，保留时间较长。

　　根据β-内酰胺类抗生素和其高分子杂质的分子量，研究人员比较了数种凝胶介质，最后选用SephadexG-10作为β-内酰胺类抗生素高分子杂质分离色谱系统的凝胶介质，发现SephadexG-10排阻分子量在1000道尔顿左右。

　　凝胶色谱方法验证的内容主要有：系统适用性试验（理论板数、拖尾因子、精密度和分离度等）、对照溶液的线性、对照溶液的精密度（RSD）、最低检测限与定量限、F值的重现性、聚合物测定结果的重现性等。

　　β-内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备对照品，不能采用对照品法定量。中国药品生物制品检定所金少鸿等研究者，根据β-内酰胺类抗生素在不同离子强度的介质中具有不同表现状态的性质，首次建立了凝胶色谱自身对照外标法定量测定β-内酰胺类抗生素中的聚合物。此方法已经载入《中国药典》2000年版和2005年版，用于国产β-内酰胺类抗生素的质量控制，并已被国内外β-内酰胺类抗生素生产厂家广泛使用。

　　■质控研究中存在问题

　　目前，β-内酰胺类抗生素高分子杂质质量控制研究中存在着一些问题，应引起注意：因某些β-内酰胺类抗生素在特定条件下不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量，故不再继续进行研究；系统适用性试验不符合要求，例如，对照溶液与蓝色葡聚糖2000峰的保留时间不一致，对照溶液峰不能重叠或峰面积的相对标准偏差大于5.0%，分离度不符合要求等；对照品制备方法错误，如采用在溶液状态下加热或紫外光照射的方法制备β-内酰胺类抗生素聚合物对照品；质量标准中聚合物的限度较宽，无科研依据。

　　■四方面值得关注

　　目前，β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的控制研究有四方面的问题须引起药品研制、生产人员的关注。

　　*高分子杂质影响因素

　　首先要从产品的制备工艺和分子结构特点分析可能产生的高分子杂质，并研究温度、光照、水分及溶液pH值等对高分子杂质含量的影响，以明确高分子杂质产生的影响因素，用于指导优化制备工艺、选择适宜的贮藏条件、制定有效的质量控制指标和限度，以及确定合适的临床使用方法。

　　*检查方法

　　高分子杂质的检查方法通常应参照中国药典的方法，重点考察系统适用性，并要进行方法验证，这一点对新药尤为重要。

　　*对照品的制备

　　如果某些β-内酰胺类抗生素在特定条件下不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量时，可以用结构与研制产品类似，且能够完全缔合的其他药物制备对照品，进行自身对照外标法定量，但在计算结果时应考虑二者分子量的差异。例如，硫酸头孢噻利在特定条件下不能完全缔合，可以选择结构与头孢噻利类似的头孢曲松制备对照品进行定量；硫酸头孢匹罗可以采用头孢他啶制备对照品进行定量。

　　*质量标准

　　《中国药典》2005年版中供注射用头孢类抗生素原料药和注射剂大都纳入了聚合物检查项，青霉素类抗生素口服原料药和制剂也定入了聚合物检查项。因β-内酰胺类抗生素高分子杂质的含量与生产工艺直接相关，同一产品采用不同的生产工艺，其聚合物的含量也不同，且高分子杂质的含量直接影响过敏反应的发生率，故在质量标准中控制高分子杂质的含量是控制产品质量、降低过敏反应发生率，保障临床用药安全的有效措施。通常注册申请人应考虑将高分子杂质检查纳入质量标准，并制定合理的限度；或作为企业内控质量标准的检查项目，高分子杂质的限度与其他杂质一样，同样要有安全性研究结果的支持。

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　　高分子杂质系指药物中分子量大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在1000~5000道尔顿，个别可至10000道尔顿。

　　β-内酰胺类抗生素高分子杂质有外源性和内源性两种。外源性一般源于发酵工艺，为蛋白、多肽、多糖等杂质与抗生素结合的杂质。内源性系指抗生素药物自身聚合的产物。聚合物既可来自生产过程，又可在贮藏过程中形成，甚至在用药时也可以产生。如阿莫西林颗粒在采用开水冲服时，其高分子杂质可增加100倍。

　　β-内酰胺类抗生素主要包括青霉素和头孢菌素两大类，除青霉素G和V外，临床中常用的β-内酰胺类抗生素均为半合抗生素，故除青霉素G和V中还含有少量青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽外，其他产品中的高分子杂质主要是聚合物。