药用植物基因资源保护与功能基因研究

  摘 要 :我国丰富的药用动植物包含了与药物形成有关的丰富基因资源,包含了在漫长的时间和广阔的空间里积累下来的多种变异,是人类赖以生存和持续发展的重要物质基础,是创造未来财富的源泉。世界各国十分关注药用植物功能基因的研究,越来越多药用植物功能基因被克隆和专利保护。基因组学的研究带动了生物学研究的发展和技术的进步,各种新的概念和技术不断出现,虽然理解并利用些技术需要时间和实践,但对新技术在功能基因研究中的潜力及对功能基因研究的促进速度需要足够的估计,以免在激烈的基因资源争夺中丧失本该属于自己的资源。现已有可能进行不同种质、化学成分、功能基因组的综合协同研究,应可能形成有中国特色的中药材研究,为中药材资源的优良种质鉴定和生物多样性保护及中药的可持续发展作出贡献。

  人类社会的可持续发展不仅是中国也是全世界21世纪的重要战略议题。可持续发展要建立在资源的可持续利用的基础上,生物多样性是持续发展的重要资源,其中药用植物基因多样性也是重要的战略资源。

  1. 药用植物基因资源保护和利用的重要性

  的高新技术还不能创造基因,只能在生物体之间转移、复制或修饰基因。在谈及药用植物基因资源保护和利用时应有两层含义,一是药用生物丰富的基因资源及其多样性是持续发展的基础,对其多样性的保护应给予特别的重视。药用植物多样性基因资源存在于多种多样的物种(品种)及其亲缘植物中,包含了在漫长的时间和广阔的空间里积累下来的多种变异,是创造未来财富的源泉,是人类赖以生存和发展的重要物质基础。二是基因资源作为一种不同于常规意义的资源已经成为可争夺的又一重要战略资源。全面开展基因功能的研究(功能基因组学和蛋白质组学的研究)已成为后基因组时代生命科学最重要的前沿领域,生物资源功能基因研究正向实际应用转移。基因序列是基因研究的基础,而基因专利则是基因产业的基础,虽然对基因专利还存在种种看法,随着注册基因的不断增多,我们不能不对药用植物基因资源及相关基因产业的未来予以特别的关注。

  1.1药用植物基因资源及其多样性是持续发展的基础

  随着中药现代化的进程,中药的规范化种植受到极大重视。但因作为源头的药用植物种质资源(基因资源)种类繁多、是野生种、存在混杂、退化等情况,已成为一瓶颈问题,因此从众多的种质资源中挑选优良种质是一个迫切的任务。即使在良种被推广之后,也还存在如何保持种质的遗传多样性(包括暂时未被认识和利用的种质资源)的问题,这对防止遗传基础过窄,品种逐渐单一化,避免农业育种已出现过的失误也很重要。遗传基础狭窄的栽培作物对环境变化或病虫害的抗性大大降低。由此已数次使农业生产造成巨大损失,象美国的杂交玉米因为都来自T细胞质而在1970年因小斑病流行而造成巨大损失的情况,使美国玉米的收成损失了15%,损失10亿多美元。为了避免种质单一带来的脆弱性(Vulnerability),必须一开始就保护种质资源的多样性。

  由于野生植物资源的破坏十分严重,已构成对传统医药的一种现实的威胁。物种的灭绝意味着这些物种所携带的遗传基因也随之消失。我们不希望人类面临研究手段越来越先进而研究对象越来越稀少的尴尬境地。

  1.2药用植物基因资源研究具有知识产权和产业化意义

  基因资源是有限的战略资源,从种质资源中分离出的基因或者用种质资源育成的品种具有知识产权,往往具有很高的价值。目前世界各国均将研究重点放在种质资源的基因鉴定与分离方面,展开了激烈的竞争,形成了一场"基因大战",人类基因资源自然是首要的战场,但其他生物的基因资源开发也硝烟弥漫。由于基因鉴定与克隆技术发展迅速,各国都注意这方面人力、财力的投入,因此未来10-20年内将是基因大战的关键时期。在这一关键时期,谁占有了基因,谁就掌握了主动权。因此,不仅要有基因测序的数量,还要看拥有多少基因专利。将所找到的基因拿到完整的序列、经过蛋白的表达、经过蛋白功能的验证并能明确一定的用途,就可能申请专利。功能基因及蛋白在疾病诊断、药物开发中的重要性已被广泛接受,已成为今后各大制药公司争夺的主要阵地。

  中国有丰富药用植物资源,共11146种,许多是中国特有物种,虽然大多数的遗传背景资料都很缺乏,其蕴涵的基因资源却迫切需加以保护与开发,这是我国药用生物资源可持续利用所必需的基础。但面对如此浩瀚而遗传背景有限的药用植物种类,如何进行基因组研究,在财力,技术普及程度及实验材料选择方面都会遇到药用植物特有的一些问题。

  药用植物区别于其他作物的特点是不同的药用植物含有各自不同的药用成分,而这些药用成分的形成是其特有基因的产物,因此,最需保护的是独具特色又有广阔应用前景的"次生代谢物合成相关功能基因"。开展具有中国特色的中国药用动植物功能基因组研究,建立和完善我国药用植物重要功能基因组研究和重要功能基因发现的技术体系,获得具有我国自主知识产权、功能明确和有应用前景的重要基因,进而带动相关制药产业的发展是紧迫任务,它将对我国健康事业发展作出巨大贡献。

  2. 药用植物功能基因研究的可行性

  "药用植物功能基因研究"就是从功能基因入手阐明药用植物有效成分的生物合成及其调控机制。其内涵包括了生物及药物研究的诸多方面:例如利用分子生物学和生物信息学方法系统地分离与中药有效成分的生物合成及其代谢调控相关的基因;建立和比较药用植物的表达谱,对相关基因进行功能分析,确定影响中药有效成分含量和品质的基因,并获得同一类又有不同药效活性的化合物形成的生物信息数据库;建立道地药材的真伪鉴别系统,确保中药材的品质;保护名贵、稀有中药材种质资源;利用分子设计等理论,通过组合化学技术合成或催化或体内体外催化合成天然产物或为新药的研究提供先导化合物等。

  2.1各种技术的发展都有应用于中药功能基因研究的可能

  中药治疗疾病已有几千年丰富经验,中药中已被现代研究确证的生理活性物质的相关基因资源应是优先研究的方向。在最大限度地保护中药基因资源不流失的基础上,可以利用基因组及相关现代生物信息学技术手段,对中药资源宝库进行系统的信息化挖掘,发现、分离和克隆重要功能基因,使之用于以转基因方式或绿色化学方式为主的现代中药产业。有目的的分离天然产物合成重要的功能基因,尤其是一些活性产物生物合成关键基因和相关基因(酶),在体外重现其相关的催化反应,完成常规化学方法不易实现的反应步骤将提供绿色化学所需要的工艺,并可应用于新药研究。该项研究是深一层次的中药资源开发,对于实现中药现代化有深远的意义。

  随着后基因组时代的到来,功能基因研究的各种新概念、新技术不断出现,现列举一些技术以便思考在药用植物功能基因研究中的可能应用。

  表1 功能基因研究中可能应用的分子生物技术

  ◇植物的表达序列标记(expressed sequence tag, EST)与"电子"cDNA文库筛选

  ◇药用植物功能蛋白质组(functional proteomics)研究;

  ◇特定代谢时期细胞功能簇( cellular role cluster,CRC)分析和功能蛋白质组表达图谱用于基因组功能提示的可行性;

  ◇基因表达指纹(gene expression fingerprinting,GEF);

  ◇基因表达系统分析(serial analysis of gene expression,SAGE);

  ◇差异显示(differential display);

  ◇cDNA3′端限制酶切片段显示(display of 3′end restriction fragments of cDNAs);

  ◇分子指数的RNA指纹(RNA fingerprinting by molecular indexing,MI);抑制性

  ◇消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH);

  ◇基因芯片(gene chips);

  ◇药用植物次生代谢调控机制研究;

  ◇功能基因和次生代谢酶基因的克隆、表达和鉴定。

  2.2研究思路和选材的重要性

  虽然各种手段以及技术的新进展都有应用于中药材功能基因研究的可能,但是先进的技术不等于先进的思想,假如取材不对先进的设备也无能为力,理解并利用这些技术需要时间和实践,但对这些新技术在功能基因研究中的潜力及对功能基因研究的促进速度也需要足够的估计。

  功能基因的研究与种质资源的鉴定、保存和优良种质选育是互相促进的,因为在中药材种质资源的鉴定和评价中,'有效成分'含量和比例的多少是作为评价药材质量和筛选核心种质的主要依据。功能基因及其表达与功能基因组的研究有可能提供一个与有效成分关系为直接的种质资源鉴定和评价指标。现已有可能进行不同种质、化学成分、功能基因组的综合协同研究,形成有中国特色的药用植物研究理论体系。

  3. 药用植物基因资源的来源和分类

  我国拥有世界上最大的绿色药库,在这些药用植物资源中蕴藏着极丰富的植物遗传、生理和生态现象,这些生命现象也是一种资源。其中绝大部分是还未被人类充分认识的野生中药材。

  面对如此丰富的基因资源,如何从众多的植物中确定研究对象,需要综合考虑。基因研究的投入较大,还有一个重要问题是药用植物大多数遗传背景都不很清楚,各种植物有几对染色体也很难查到,对基因组研究和基因定位带来很大困难。国家不可能投资于如此众多的药用植物基因组的测序,且全基因组测序也并不是发现基因最有效率的方法。因为人类基因中只有2%的序列编码蛋白质,而药用植物的功能基因序列所占基因组比率也没有进行过深入的研究。已完成基因组测序的模式植物拟南芥,有5条染色体,基因组约120Mb,比玉米基因组2500Mb、小麦16000Mb相对较小。拟南芥不带有大量重复DNA,但是它有调控发育、代谢、对环境作出响应及疾病产生抗性等一整套完整基因。因而它的基因组序列为分析相关植物种类基因功能、在其他物种中寻找同源基因或相似基因提供了有效手段。鉴别拟南芥的编码特定性状如病害耐受、营养性状或产量的基因,将使得在其他植物中鉴别这类基因更加方便。由此基因组研究不需要也不可能遍及每一种植物。

  因此,当务之急是从功能基因入手,重点开展中草药的功能基因组研究,这是中草药的基础研究中的重中之重。

  药用植物基因资源大体可以分成三类:第一,有效成分生源途径中代谢关键酶的基因:紫杉烯合酶、银杏内酯环化酶等。第二,优良农艺形状或特殊生理现象基因:如控制红花刺的基因、甘草种子的抗逆性基因。特殊生理现象的例子包括:雪莲Saussurea hypsipeta、羌活的适应特殊环境的基因,栝楼、银杏、绞股蓝的性别决定基因,苦楝Melia azedarach、银杏的抗虫抗病基因;甘草黄芪枸杞的抗逆基因;有毒中药荨麻Urtica thunbergiana和鲜用中药地黄藿香的药用蛋白和多肽基因。第三,重要标识基因:用于鉴定药用植物的分子标记现已有大量报道,随然不能肯定这些基因的功能,但是在构建基因图谱和分子标记辅助育种等方面都需要这些分子标记。

  开展药用植物基因研究需要合理选材,在选材时要遵循一些基本原则。首先是重要性原则,欲研究的对象应该是疗效明确、应用广泛的重要中药,除了是做基础理论探讨的模式药用植物如用羽扇豆研究生物碱的基因调控机制之外,更要研究解决那些生产中急需解决的问题。人们已经选中的研究对象都是那些极为重要的药用植物如人参、甘草、黄芪红豆杉、甜叶菊番红花等,如人参是最重要的中药,素有"百草之王"之称;甘草是用途最广的配伍药,有"十药九草"之称。其次,做有效成分基因调控的研究应有前人的化学工作基础,那些有效成分明确且含量低、化学合成困难的中药才会有意义。另外,欲研究关键酶基因的材料还应该是合成途径(生源途径)做过研究,而且遗传背景也比较清楚的药用植物。第三,特殊遗传、生理、生态现象的中药或者是濒危药用植物,当然,标识基因可能不都是功能基因。

  4. 药用植物功能基因研究的目前动态

  下面就部分药用植物基因资源研究状况作一初步介绍,由于该领域进展较快,不断有新基因或EST片段注册,我们收集的资料是2002年3月以前注册的基因或EST片段。

  4.1药用植物功能基因研究情况:

  药用植物功能基因研究已在欧美、日本等国进行了多年,主要是黄酮类化合物合成相关基因的克隆、植物细胞色素P450基因克隆及萜类化合物合成基因克隆。随着人类基因组的研究进展和技术进步,近年来进展较快。我们对12种药用植物的功能基因特别是萜类化合物合成相关基因注册的初步统计结果表明自1999年始注册的基因数目有较大幅度增加。

  在这些药用植物中,功能基因克隆注册最多的几个植物分别是长春花青蒿、甘草和红豆杉。注册基因最多的国家是日本、中国、德国和美国,黄酮类化合物生物合成途径功能基因研究起步较早,大多数的基因都已被克隆和功能鉴定,并已实现了利用花青素合成基因修饰改变花的颜色。

  细胞色素P450酶类因在天然产物的氧化修饰及在植物代谢外源化合物能力上的特殊作用及潜在的应用价值,其相关基因克隆备受关注。在我们的统计中12种药用植物注册基因125个,25个属的植物共注册黄酮类合成基因69个。而细胞色素P450的研究范围则广得多,从59个属的植物中共注册了207个基因。

  4.2药用植物功能基因研究动向:

  基于对功能基因的关注,希望探索一个功能基因克隆的简捷快速的途径,一些国家对药用或资源植物进行了大量的EST测序工作。较为突出的是加拿大在2002年报道了甜叶菊Stevia rebaudiana大量的EST测序结果,有5549项之多。美国对葡萄Vitis vinifera进行了系统的cDNA 测序工作,在2002年1月报道了1182个cDNA片段。番红花是名贵药材,西班牙在2001年就已报道了343个EST片段的测序结果。说明了各国对功能基因研究的重视。

  4.3药用植物基因的专利情况:

  基因资源是有限的资源,基因被克隆一个就少一个,被别人保护起来我们就不那么方便了。基因资源的争夺已拉开序幕,具有专利注册号的药用植物基因或DNA片段也越来越多。虽然我们一时看不出这些片段的应用价值,但在6种植物中有274条基因片段申请了专利注册号,其中大部分与黄酮代谢有关。

  根据1996-2002的美国专利的初步检索,长春花,红豆杉均有功能基因专利公开,而与P450有关的基因和核酸顺序有40项之多,分别与植物脂肪酸羟基化、黄酮化合物羟基化、柠檬烯(limonene)羟基化等多种羟基化反应有关;另外用基因工程方法改变花朵的颜色(花青素含量)的方法也申请了专利。植物P450代谢除草剂的能力及应用也是专利保护的要点。

  4.4我国药用植物基因克隆现状

  中国完成人类基因组测序计划的1%,极大地带动了我国基因组研究,中国超级杂交水稻基因组研究计划、家猪基因组研究计划及中国人基因组与多态性研究计划相继实施。但我国在药用植物基因资源开发方面的工作还处于起步阶段。我国在最近几年由中科院植物所、植物生理所、中国医学科学院药物所及上海中医药大学注册了15个基因,其中11个与青蒿萜类合成有关,2个与中国红豆杉有关,2个与黄芪代谢有关的基因。但目前尚未见到我国在黄酮类化合物与细胞色素P450相关基因克隆及注册方面的工作。

  国家知识产权局新闻发言人曾表示,中国重视基因资源保护工作,现在包括国家知识产权局等部门在内的有关方面正在研究情况,以便对基因资源外流采取措施,严加防范。发言人表示,中国是一个基因资源十分丰富的国家,过去由于科技水平发展的问题,中国没有充分认识到基因资源保护的重要性,国外一些组织利用各种手段,如通过出资合作项目获得基因资源等,造成中国野生动植物及人类基因等基因资源外流的情况。国家知识产权局有关人士说,基因资源外流现象在发展中国家是一种普遍现象,传统文化、基因资源和民间文艺的三项知识产权保护已引起世界知识产权保护组织和各发展中国家的高度重视。目前中国也积极参与国际上的政府间讨论,如达成基因资源利用的利益分享协定,将对抗衡发达国家攫取中国基因资源十分有利。这为实现生物资源的序列化、产权化、产业化,为充分保护、利用与开发我国的生物资源奠定了坚实基础。