流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程

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流行性乙型脑炎(下称乙脑)灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞,培育后收获病毒液,加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。用于预防乙脑。

1 毒种

1.1 毒种来源

P3株病毒,每3~5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查P3株的保护力,以了解该毒株的有效性。P3株干燥毒种由中国药品生物制品检定所分发。

1.2 毒种检定

1.2.1 无菌试验

毒种启封和每次传代后均需做无菌试验,合格者方可使用。

1.2.2 病毒滴定

每正代必须用体重7~9g小白鼠进行脑内滴定,滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。

1.2.3 纯毒试验

生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验,以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在500以上。生产过程中如对毒种发生疑问,应及时进行鉴定。

1.3毒种传代

分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代,由正代传递一代直接用于生产称亚代。每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。

传代时选用体重7~9g健康小白鼠或乳鼠,脑内接种病毒,72小时后选眼结膜正常,有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠,无菌取脑并进行无菌试验。

1.4 毒种保存

鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下,无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液,分装小瓶冻存于-60℃以下,无菌试验合格后备用。

2 疫苗制造

2.1 细胞制备

2.1.1 地鼠

选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水,应废弃。

2.1.2 细胞消化及培养

取肾剪碎,用适量的胰蛋白酶溶液消化。用营养液分散细胞,制备细胞悬液,分装培养瓶,于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。

2.1.3 外源因子检查

每生产批细胞留5%(或不少于500ml)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外,细胞浓度和处理均与生产过程平行进行,至原液收获之日用显微镜观察,应无病变发生。并用0.2%~0.5%豚鼠红细胞(4℃保存不超过7天)进行血吸附试验,置4~8℃30分钟判定结果,再置20~25℃30分钟再次判定结果,均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性,在同种细胞上继续盲传,如传出病毒,该批细胞制备的疫苗应予废弃。

2.2 病毒接种和培育

挑选生长良好的细胞瓶,充分淋洗细胞后加入适量维持液,接种病毒,病毒量不得>7.0LogLD50/1.0ml。在适当温度下培育适当时间,弃去病毒培养液,换以新维持液,继续培育一定时间。

疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。

2.3 原液

2.3.1 过滤

选择有典型细胞病变的培养瓶,经肉眼检查无菌者进行澄清过滤,细胞质量好时,可再加入新维持液,继续培育,再次收获病毒液。

2.3.2 病毒灭活

过滤后的原液,于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛溶液,其最终浓度不得超过0.05%,置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后加入硫柳汞防腐剂,其最终浓度不得超过0.01%。

2.3.3 原液检定

2.3.3.1 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.3.3.2 病毒滴定

每个滴定批代表疫苗不得超过15万ml,将样品10倍系列稀释,取至少3个稀释度,每个稀释度用体重7~9g小白鼠4只,每只脑内接种0.03ml,逐日观察,3日内死亡者不计,观察14天,滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判为合格,不合格者可重试一次。

2.4 半成品

2.4.1 半成品取样

无菌试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液,取样做灭活试验、效力试验和无菌试验。每次解剖的地鼠制备的疫苗为一生产批,按生产批进行检定,但每批灭活试验代表疫苗量不得超过15万ml,每批效力试验代表疫苗量不得超过100万ml。无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.4.2 半成品检定

2.4.2.1 灭活试验

(1)动物法:将样品脑内接种体重12~14g小白鼠8只,每只 0.03ml,同时腹腔接种0.5ml,为第一代;7天后将第一代小白鼠处死3只,取脑做成10%悬液,脑内接种6只小白鼠,为第二代;7天后将第二代小白鼠处死3只,同法接种6只小白鼠,为第三代。从接种之日起逐日观察14天,每代小白鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡者外,全部健存为合格。

若传代3日后有个别小白鼠死亡,应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠,观察14天,该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡,该批疫苗应重试,重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试,查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验,若仍传出活病毒,该批半成品应予废弃。

(2)细胞培养-动物法:将样品25ml透析24小时后,接种地鼠肾细胞或BHK21细胞,每ml样品接种不少于3cm2细胞片,置培养病毒的温度下培育14天,不得有细胞病变出现。到期的培养液脑内接种体重7~9g小白鼠10只,每只0.03ml,观察14天,应全部健存。若有死亡者应查明原因或重试,重试合格者仍可使用。不合格者应废弃。

以上两种灭活试验方法可任选一种。

2.4.2.2 效力试验

采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清由中国药品生物制品检定所提供。

将被检苗(T)和参考苗(R)稀释成1∶32腹腔免疫体重12~14g小白鼠10只,每只0.5ml,免疫2次,间隔7天,第二次免疫后7天采血,分离血清,同组小白鼠血清等量混合,56℃30分钟灭活,备用。

稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清,分别与稀释好的病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合,同时将稀释好的病毒再1∶2稀释,作为病毒对照,置37℃水浴作用90分钟,接种6孔板BHK21细胞,每孔0.4ml,37℃孵育90分钟,加入含甲基纤维素的培养基覆盖物,于CO2孵箱中培育5天,染色,蚀斑计数,计算被检苗和参考苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50~150之间。

判定标准

(1)合格:T≥(RA+RB)/2-0.33

(2)重试:(RA+RB)/2-0.66<T<(RA+RB)/2-0.33

(3)不合格:T<(RA+RB)/2-0.66

2.4.2.3 残余牛血清蛋白含量测定

用检定所认可的试剂和方法测定,残余牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。

3 成品检定

3.1 外观检查

疫苗应为橘红色透明液体,无异物,无沉淀。

3.2 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3 化学检查

按《生物制品化学检定规程》进行。pH值为7.2~8.0。游离甲醛不高于0.05%,硫柳汞不高于0.01%。

3.4 安全试验

每批疫苗腹腔注射体重18~20g小白鼠4只,每只0.5ml,逐日观察3天,均应健存,如有小白鼠死亡,除检查原因外,应立即进行重试。

3.5 亚硫酸氢钠检定

分装后的亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的60%。无毒性试验系将样品稀释成1∶100,腹腔注射体重18~20g小白鼠2只,每只0.5ml,观察5日,应全部健存。

4 保存与效期

保存于2~8℃暗处。自效力检定合格之日起效期为2年。

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