森林脑炎疫苗制造及检定规程

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森林脑炎疫苗系用森林脑炎病毒“森林”株接种于地鼠肾单层细胞,培育后收获病毒液,加入甲醛溶液将病毒灭活后制成。用于预防森林脑炎。

1 毒种

1.1 毒种来源

卫生部长春生物制品研究所保存之冻干毒种“森林”株。每3~5年会同中国药品生物制品检定所应用新分离的流行株病毒攻击,检测“森林”株的保护力,以了解该毒株的有效性。

1.2 毒种检定

1.2.1 无菌试验

毒种启封及每次传代后,均需做无菌试验,合格者方可使用。

1.2.2 病毒滴定

每正代必须用小白鼠进行脑内滴定。滴度≥9.0LogLD50/1.0ml方可用于生产。

1.2.3 纯毒试验

生产前须用小白鼠脑内法做中和试验鉴定毒种的特异性,中和指数必须在500以上。生产中如对毒种有怀疑,应及时进行鉴定。

1.3 毒种传代

分正亚代传递。传递代数正代不得超过15代,传代时选用体重10~12g健康小白鼠或乳鼠。每次毒种传代不得少于3个鼠脑。脑内接种病毒,72小时后选择眼结膜正常,有典型战栗、痉挛、肢体麻痹的小白鼠,处死后无菌取脑,并进行无菌试验。如发现污染者,应及时废弃。

1.4 毒种保存

鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下,无菌试验通过后方可使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成10%脑悬液,分装小瓶,冻存于-60℃以下,无菌试验合格后备用。

冻干毒种保存在2~8℃。

森林脑炎病毒“森林”株属二类毒种,必须设专人按有关规定负责管理,使用前、后记录清楚。

2 疫苗制造

2.1 细胞制备

2.1.1 地鼠

选用2周龄左右的健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水,应废弃。

2.1.2 细胞消化及培养

处死地鼠,无菌取肾,加入适量胰蛋白酶液消化。用营养液分散细胞,制备细胞悬液,分装培养瓶,于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。

2.1.3 外源因子检查

每生产批细胞留5%(或不少于500ml)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外,细胞尝试和处理均与生产过程平行进行。至原液收获之日,用显微镜观察,应无病变发生。并用0.2%~0.5%豚鼠红细胞(4℃保存不超过7天)进行血吸附试验,置4~8℃30分钟判定结果;再置20~25℃30分钟再次判定结果,均应为阴性。如有可凝病变或血吸附可疑阳性,在同种细胞上继续盲传,如传出病毒,该批细胞制备的疫苗应予废弃。

2.2 病毒接种和培育

2.2.1 生产毒种配制

将鼠脑毒种解冻乳化,制成10%~20%脑悬液,离心,取上清液作为毒种。亦可用冰冻鼠脑毒种悬液感染细胞。

2.2.2 病毒接种和培育

选择生长良好的细胞瓶,充分喷洗细胞后,加入适量含有病毒的营养液(病毒量不得大于7.0LogLD50/1.0ml),在适当温度下培育适当时间,弃去病毒培养液,换以新维持液,继续培育一定时间。

2.2.3 疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。

2.3 原液

2.3.1 病毒灭活

选择有典型细胞病变的培养瓶,经肉眼检查无菌者进行澄清过滤,按瓶取无菌试验及病毒滴定样品,取样后立即加甲醛溶液和硫柳汞,使甲醛的最终浓度为0.05%,硫柳汞为0.005%,置适当温度下灭活。

无菌试验为接种琼脂斜面培养基,3天判定,长菌者废弃。

2.3.2 过滤合并及取样

单瓶无菌试验未长菌、灭活到期、病毒滴定合格的疫苗进行过滤合并,摇匀后做无菌试验,取安全试验和效力试验样品。

安全试验每批合并检定疫苗量不得超过15万ml,效力试验每批合并检定疫苗量不得超过100万ml。检定批号和成品批号应一致。

2.3.3 原液检定

2.3.3.1 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.3.3.2 病毒滴定

将滴定样品做10倍系列稀释,取至少3个稀释度,每个稀释度病毒液脑内接种体重7~9g小白鼠4只,每只0.03ml,逐日观察,14天判定结果(3天内非特异性死亡者不计,)滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判为合格。不合格者可重试一次。

每个滴定批代表疫苗量不得超过15万ml。

2.4 半成品检定

2.4.1 灭活试验

(1)动物法:将样品脑内接种体重12~14g小白鼠8只,每只0.03ml,同时腹腔接种0.5ml,为第一代;7天后将第一代小白鼠处死3只,取脑做成10%悬液,脑内接种6只小白鼠,为第二代;7天后将第二代小白鼠处死3只,同法接种6只小白鼠,为第三代。每代小白鼠从接种之日起逐日观察14天,在观察过程中全部健存为合格,接种后3日内非特异性死亡者不计。

若传代3日后有个别小白鼠死亡,应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠,观察14天,该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡,该批疫苗应重试,重试合格后仍可使用。若传出活病毒应重试,查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验,若仍传出活病毒,该批半成品应予废弃。

(2)细胞培养-动物法:将样品50ml装入透析袋内,放入6000~8000ml维持液中于4℃透析24小时,接种地鼠肾细胞或BHK21细胞,每ml样品接种不少于3cm2的细胞片,置培养病毒的温度下培育14天,全部健存判为合格。若有死亡者应查明原因或重试,重试合格者仍可使用,不合格者应废弃。

以上两种灭活试验方法可任选一种。

2.4.2 残余牛血清蛋白含量测定

用检定所认可的试剂和方法测定,残余牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。

2.4.3 效力试验

每批疫苗腹腔免疫体重10~12g小白鼠35只,于第1、3、5日共免疫3次,每次每只小白鼠0.3ml。另取同批小白鼠35只作为空白对照。于第10日以“森林”毒种0.3ml进行腹腔攻击,每天观察1次,观察21天判定结果。对照组LogLD50/0.3ml在7.5以上,免疫保护指数达100000以上为合格。不合格者可重试1次。

3 成品检定

3.1物理检查

疫苗应为橘红色透明液体,无异物。

3.2 化学检查

按《生物制品化学检定规程》进行。pH值为7.2~8.0。游离甲醛不高于0.05%,硫柳汞不高于0.01%。

3.3 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.4 安全试验

每批疫苗腹腔注射体重18~20g小白鼠4只,每只0.5ml,逐日观察,3日内全部健存判为合格。如有小白鼠死亡,除检查原因外,应立即进行重试。

3.5亚硫酸氢钠检定

分装后亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的60%。无毒性试验系将样品稀释成1∶100,腹腔注射体重18~20g小白鼠2只,每只0.5ml,观察5日,应全部健存。

4 保存与效期

保存于2~8℃暗处。自效力检定合格之日起效期为2年。

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