靶向蛋白酶：成功、失败与前景（二）

　　■鉴别和确认蛋白酶靶标

　　了解健康与病变中蛋白酶信号的一个关键是鉴别蛋白酶的内生底物，目前已经应用许多方法来达到这一目的，计算生物学、遗传学和蛋白质组学的进展也为其提供了有力手段。例如，通过采用噬菌体展示库、组合荧光底物库或基于共价抑制剂的位置扫描库，一旦确定蛋白酶的扩展底物特性，就可以在基因组范围的基础上获得生物信息学知识，根据已确定的蛋白酶底物特性来发现潜在的底物。

　　底物搜索的遗传途径通常是采用经典的基因敲除动物模型、RNA干扰（RNAi）技术。在靶标确认中应用的另一种方法往往是动物模型与经典的蛋白酶基因敲除动物模型的结合。这种方法已经用于研究半胱氨酸组织蛋白酶在不同癌细胞模型（例如Rip1-Tag2实验鼠胰岛肿瘤模型）中的作用。

　　蛋白质组学这一工具非常适合于鉴定和确认潜在的蛋白酶靶标。一些蛋白酶底物最近已经用这种方法确定，包括MMP底物和颗粒酶B底物。

　　■蛋白酶活性的调节

　　蛋白酶活性是在转录水平受不同表达调控的，在蛋白质水平受无活性酶原的激活和抑制剂及辅因子的结合调控。

　　活性调节的基本机制存在于大多数的蛋白酶中。潜在的蛋白酶原等待一个激活的信号，这种信号可能来自变构激活体或者其他的蛋白酶。一旦激活后，底物和抑制剂竞争与蛋白酶的结合。蛋白酶活性也受到辅因子的调控，蛋白质往往是以变构的方式可逆地与蛋白酶和/或抑制剂结合，影响其最终活性。蛋白酶活性的其他重要调控物是它们内生或外生的抑制剂。一种抑制剂可以抑制几种蛋白酶，如所有金属肽链内切酶（180种以上）的主要抑制剂仅由4种蛋白质组成：金属蛋白酶的组织抑制剂1（TIMP1）、TIMP2、TIMP3和TIMP4。

　　迄今为止，在靶向蛋白酶信号的一些途径中，对蛋白酶进行抑制的探索最为广泛。除了直接阻滞靶标蛋白酶的活性外，蛋白酶抑制剂也阻滞下游蛋白酶的激活，或者与辅因子联合影响蛋白酶的活性。

　　■直接抑制

　　◆大分子 在血液凝固领域已经开发出一些以蛋白酶为靶标的新型大分子抑制剂。

　　第一个例子是天冬酶的活性，因此能刺激癌细胞的凋亡。细胞培养的初期研究表明，其对癌细胞具有明显的凋亡作用和很好的选择性，包括能增强其他化疗药物的敏感性。此外，这类化合物在肿瘤异种移植物的实验鼠模型中也有效，未显示毒性。

　　阻滞内生蛋白酶抑制剂的另一条途径是运用反义分子。Aegera Therapeutics公司最近宣称，已开始AEG35156的I期临床试验——这是X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的第二代反义寡核苷酸抑制剂，能促进癌细胞凋亡。单克隆抗体也可能具有潜力，新上市的抗血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂1（PAI1）单克隆抗体33H1F7显示，能将活性PAI1转换成组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的底物，从而促进实验鼠肠系膜动脉模型的的溶栓治疗。