蒙药地锦草总黄酮提取工艺研究
蒙药地锦草总黄酮提取工艺研究地锦草为大戟科植物地锦Euphorbiae humifusae willd．的干燥全草。具有止血、燥湿"协日乌素"、愈伤、清脑、清脉热的功能。用于便血、创伤出血、衄血、吐血、肺脓疡、咯脓血痰、中风等。是蒙医常用药之一，如意至宝丸（额尔郭乌日勒）等方剂的主要药。地锦草主要含槲皮素甙及素、山奈素甙及素、地锦草素等黄酮类化合物。其煎剂、醇提液及地锦草素均有抗菌、止血等作用。我们曾对地锦草水提取液、乙醇提取液及总黄酮液抗自由基作用进行研究，结果证明地锦草有很强的清除和抑制自由基的作用。为进一步研究其有效成分，探索地锦草总黄酮提取最适条件，为提取工艺提供信息，以总黄酮含量为考察指标，采用正交实验等方法对地锦草总黄酮提取工艺进行了系统研究。
1 材料与仪器 药材由本院附属医院蒙药制剂室提供，经我院蒙药系鉴定教研室鉴定。均为《中国药典》1995版本品种Euphorbiae humifusae willd．的干燥全草。芦丁对照品由中国药品生物制品检验所提供，批号为080-9303，其它化学试剂均为AR级，实验用水为亚沸提纯水。
日立557双波长双光束分光光度计，754分光光度计（上海三分厂），FA160电子天平（上海天平仪器厂），PHS-WI型智能酸度计（杭州万达仪表厂）。
2 实验方法 2．1 最大吸收波长及稳定性考察：精密量取芦丁对照品液和样品液各5．0ml，分别置25ml容量瓶中，加水至6ml，加5％NaNO2液1．0ml，放置6min，加10％Al（NO3）3试液1．0ml，放置6min，加10％NaOH试液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂作空白，于557双光束／双波长分光光度计上进行全波长扫描，最大吸收波长为λmax500nm，同时，在500nm波长处进行时间扫描，结果显示150min内基本稳定。
2．1．2 标准曲线的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品10．0mg，加甲醇溶解，转入50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品液（0．2mg／ml）。精密吸取该液0．0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0ml，分别置25ml容量瓶中，加水至6ml，加5％NaNO2试液1．0ml，放置6min，加10％Al（NO3）3试液1．0ml，放置6min，加10％NaOH试液10ml，加水至刻度，摇匀，放置15min以相应试剂作空白，于500nm处测定吸光度。以浓度（C）与吸光度（A）进行直线回归，得回归方程为Y=0．0209+0．3467X，γ＝0．9997。在0．20～1．20mg范围内呈线性关系。
2．1．3 加样回收率测定：称取5．0g地锦草粗粉3份，精密称定，分别精密加入芦丁对照品，按样品制备法制备，并照标准曲线制备方法测定，计算其回收率。结果见表1。
表1 加样回收率测定结果----------------------------------------------------------------------编号 样品总黄酮量 加入量 测得值 回收率（%） X±S（%） CV（%） （mg） （mg） （mg）----------------------------------------------------------------------1 37.0831 5.1435 41.3873 97.742 36.1533 5.0111 41.4315 100.74 98.77±1.71 1.733 37.1173 5.1001 41.4110 97.83----------------------------------------------------------------------- 2．2 提取方法的选择 2．2．1 水提取法：称取地锦草粗粉5．0g，加水200ml，浸泡30min，煮沸60min，过滤。共煎煮3次。合并滤液定容至50ml，备用。
2．2．2 乙醇提取法：称取地锦草粗粉5．0g，加乙醇，水浴回流1h，过滤。共提取3次。合并滤液定容至50ml，备用。
2．2．3 样品液总黄酮含量测定：精密吸取样品液3．0ml，置25ml容量瓶中，按标准曲线制备法测定吸光度，计算含量。结果见表2。
2．3 提取工艺条件优选：从表2可知，乙醇提取法优于水提取法，可采用正交实验设计，选用乙醇浓度、提取时间、提取溶剂加倍量及提取次数4因素，每个因素选择3个水平，用L9（34）正交表进行实验设计优选。结果见表3、表4。
表2 地锦草提取条件与含量关系-----------------------------------------------------------------------试验号 提取条件 含量（x±S，%） CV（%）-----------------------------------------------------------------------1 水提取法 0.1397±0.004 2.852 乙醇提取法 0.7278±0.011 1.44----------------------------------------------------------------------- 表3 因素水平表-----------------------------------------------------------------------水平 因素A乙醇浓度（%） B提取时间（h） C溶剂加倍量 D提取次数-----------------------------------------------------------------------1 60 1.0 6 12 75 1.5 8 23 90 2.0 10 3----------------------------------------------------------------------- 表4 正交试验设计及结果分析-----------------------------------------------------------------------表头设计 A B C D 试验结果-----------------------------------------------------------------------列号 1 2 3 4 总黄酮含量（%）-----------------------------------------------------------------------1 1 1 1 1 2.6742 1 2 2 2 2.8913 1 3 3 3 3.0334 2 1 2 3 3.2245 2 2 3 1 2.5386 2 3 1 2 3.0157 3 1 3 2 2.6058 3 2 1 3 3.4239 3 3 2 1 2.64l 2.866 2.834 3.037 2.617 G=2.6043l2 2.926 2.951 2.918 3.11 l3 2.889 2.896 2.725 3.227 R 0.006 0.0117 0.312 0.61 优水平 A2 B2 C2 D2 ----------------------------------------------------------------------- 2．4 分离精制方法的考察：称取地锦草粗粉25g，照正交实验最佳工艺A2、B2、C1、D3进行提取，回收乙醇，加水溶解，并定容至50ml，备用。提取液作以下分离工艺考察。
2．4．1 方法1：取上述液10ml，于水浴蒸干，用饱和石灰乳溶解，搅拌，过滤。50～60℃下调pH值至1～2，放置，析出沉淀，沉淀用甲醇溶解并定容至50ml。
2．4．2 方法2：取上述液10ml，加饱和石灰乳调pH值10～11，放置，产生沉淀，过滤，滤液用HCl调整至中性，于水浴上浓缩至干，甲醇溶解，并定容至50ml。
2．4．3 方法3：取上述液10ml，用石油醚脱色，再用正丁醇萃取3次。减压回收正丁醇至干，甲醇溶解，并定容50ml。
精密吸取总黄酮甲醇溶液，按标准曲线制备方法测定吸光度，计算含量。结果见表5。
表5 精制分离条件与总黄酮含量关系-----------------------------------------------------------------------试验号 方法 总黄酮含量（x±S，％） CV（％）-----------------------------------------------------------------------1 方法1 0．3121±0．0022 0．702 方法2 0．0400±0．0011 2．753 方法3 1．6654±0．0094 0．56----------------------------------------------------------------------- 3 讨论与小结 从实验结果表明，乙醇提取法优于水提取法（P＜0．05）。乙醇提取最佳方法是A2、B2、C1、D3，即用6倍量的75％乙醇回流提取1．5h，共提取3次。本方法提取的液体可用石油醚脱色，再用正丁醇萃取3次，减压回收溶剂至干得总黄酮精制品。
乙醇提取工艺对地锦草总黄酮含量的主要影响因素为提取次数，其次是溶剂加倍量。按A2、B2、C1、D3方案提取地锦草总黄酮。可增加得率59％，可充分利用低浓度乙醇，并用量小，降低生产成本，简便。