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《实用免疫细胞与核酸》 > 第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用

第三节 DNA重组实验中常用的技术

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一、质粒DNA的提取及鉴定

(一)质粒DNA的提取及鉴定

1.

(1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中,接入一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。

(2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中,用台式离心机于4℃以12000g离心5min,将剩余的培养物贮存于4℃。

(3)吸尽培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。

2.碱裂解法小量抽提质粒

(1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/lTris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,剧烈振荡。

(2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),缓和振荡,水浴5min。

(3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml),缓和振荡,冰浴5min。

(4)4℃以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中。

(5)可作不可作:加等量饱和酚,氯仿,振荡混匀,重复2,(4)。

(6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合,于室温放置2min。

(7)4℃以12000g离心5min。

(8)小心吸尽上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,再将附于管壁的液滴除尽。

(9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA,同上离心去上清真空抽干。

(10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶),振荡,贮存于-20℃。

(二)质粒DNA的大量制备

(1)同上1.(1)

(2)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中,37℃振荡培养至A590=1.0(5~6h)。

(3)加氯霉素(170μg/ml)扩增,37℃温箱中培养过夜。

(4)收集菌液于离心管中,冰浴10min。3000rpm,离心10min,去上清。

(5)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体,将悬液倒入高速离心管中,摇匀,冰浴5min。

(6)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀,室温下5min。

(7)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀,冰浴30min。15000rpm,4℃离心20min。

(8)取上清液于高速离心管中,加2倍体积的无水乙醇,混匀,入-20℃3~5h。

(9)15000rpm4℃ 离心20min。

(10)弃上清,将离心管倒放入真空泵中抽干(10~15min)。

(11)用5ml1×TE溶解,加入RNase A 15~20μl,42℃水浴4h于过夜。

(12)加入5ml饱和酚,混匀,4000~5000rpm离心5min,取上清液入5ml离心管内。

(13)分别加入2.5ml饱和酚,2.5ml氯仿,混匀后同样离心收集上清。

(14)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀,同样离心收集上清。

(15)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3~5h。

(16)10000rpm4℃离心20min。

(17)弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。

(18)离心弃上清,真空抽干,加入适量1×TE溶解质粒DNA。

(三)质粒DNA的鉴定

1.酶切反应

(1)在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer1μl,DNA 2μl,酶1μl,混匀,37℃水浴1h以上。

(2)取反应物点样,观察酶切效果。

(3)酶切完全后,70℃5min终止反应。

2.琼脂糖电泳

(1)配制所需浓度琼脂糖凝胶。

(2)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂,混匀后点样。

(3)打开电源开关,5V/cm电泳。

(4)在UV灯下观察电泳结果。

二、DNA的重组

(一)DNA的酶切与连接

(1)酶切反应

同质粒DNA的鉴定,只不过是质粒DNA换为载体DNA。若大量酶切,则成比例增加。

(2)加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀,-20℃2h以上。

(3)15000rpm离心15min,弃上清。

(4)加入75%乙醇洗涤2次,离心弃上清,真空抽干。

(5)加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。

(6)测定DNA的含量。

(7)加入线性载体DNA和含量3~4倍于载体的待插入DNA片段,连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl,在12~14℃反应12~16h。

(8)连接反应液可置-20℃保存,供转化用。

(9)关于待插入DNA片段的获得参见附注。

(二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1.感受态的制备

(1)接种单菌落于2mlLB培养液中, 37℃过夜。

(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中,37℃振摇4~6h至A590=0.4~0.6。

(3)倒入50ml管内,水浴10min,以2500~3000rpm离心5min,弃上清。

(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体,冰浴20min,同上离心弃上清。

(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。

2.重组DNA的转化

(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记,然后按下述进行:

转化项目受体菌DNA总体积
DNA对照组010μl200μl
受体菌对照组200μl0200μl
转化组190μl10μl200μl

(2)冰浴30min至1h。中间摇动3次,以防受体菌沉底。

(3)42℃90s。

(4)37℃水浴5min。

(5)加入无相应抗生素的Lb200μl,混匀后,37℃水浴30~60min。

(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布,室温下干燥,然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

(三)转化子DNA的快速鉴定-快速细胞破碎法

(1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中,37℃振荡培养至A590值为0.6~0.8。

(2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中,9000rpm离心9min,去尽上清。

(3)加入70μlCracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml,加双蒸水至200ml],混匀后,37℃水浴30min以上。

(4)15000rpm离心15min。

(5)吸取上清点样电泳,观察。

(四)转化子DNA的酶切鉴定

1.转化子DNA的快速少量抽提

(1)同本节 二.(三).1.

(2)菌液移至5mlEppendorf 管中,9000rpm,离心9min,去上清。

(3)加溶液Ⅰ100μl,溶液Ⅱ200μl,溶液Ⅲ150μl,混匀,冰浴10min。

(4)15000rpm离心15min。

(5)吸取上清,加入异丙醇1ml混匀,置室温15~30min。

(6)15000rpm离心15min,弃上清,加入75%乙醇洗涤2次。

(7)离心弃上清,真空抽干,加入适量1×TE溶解DNA。

(8)取少量DNA电泳,观察浓度。

2.转化子DNA的小量酶切鉴定同质粒DNA的小量酶切鉴定,见本节 一(三)。

(五)重组子DNA的进一步鉴定

可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定,详见本节 四。

[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段

(1)用合适的酶切割DNA并电泳。

(2)于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带,装入含1×TBE缓冲液的透析代内,用夹子封好袋口,并检查有无漏孔。

(3)将透析袋(纵长)与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳,4~5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。

(4)取出透析袋,挤出凝胶块,吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内,10000rpm离心5min。

(5)吸出上清放入离心管内,加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿,振荡混匀,10000rpm离心5min,吸出上清放入新的离心管内。

(6)加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇,于-20℃放置4~5h。

(7)于4℃,10000rpm离心15min,弃上清。

(8)用75%的酒精洗涤2次,每次均于4℃,10000rpm离心5min,弃上清。

(9)真空抽干,并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

三、地高辛配基随机标记DNA探针法

(一)概述

基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础,在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是:制备DNA探针,标记探针,检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来,非同位素标记方法发展很快,已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法,是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是:用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上(Dig-dUTP)。用随机引物及DNA多聚酶,以探针DNA为模板,合成互补DNA,化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合,加入显色底物,在碱性磷酸酶作用下,转变成深棕色或蓝色的化合物。

1.标记 本试剂盒采用随机引物标记方法,可标记少至10ng,多至3μg的DNA。能在新合成的DNA链每20~25个核苷酸,掺入一个Dig-dUTP,反应时间约为1h。

2.杂交 按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃,重复使用。

3.免疫学检测 封阻后,检测反应的第一步,抗体结合物与标记DNA结合,出现杂交的半抗原-标记DNA,显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和NBT,在几分钟内便开始出现蓝色,显色反应的过程持续3d。典型的例子是在24h后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后,尼龙膜可重新用于杂交。

4.应用 地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒,能检测0.1pg的同源DNA,能检测1μg哺乳动物DAN中的单拷贝基因,与放射性标记系统比较,此试剂盒能快速得到实验结果(从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成),而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术(包括DNA-印迹转移,菌落杂交,噬菌斑杂交及原位杂交)以替代同位素标记和放射自显影术。

(二)试剂盒成份

1.无标记对照DNA1 此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化,它们的混合比例为2:3:3,共有16个Pbr328片段,这些片段的大小分别为:4907,2176,1766,1230,1033,653,517,453,298,234,234,220和154×2bp。

2.无标记对照DNA2 此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml,已用EcoRⅠ线性化。

3.DNA稀释缓冲液 有两管,每管1ml[成分为:Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA(50μg/ml)。

4.标记对照DNA 此管内有50μl线性化pBR328DNA,按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA,每毫升含5μg合成的标记DNA。

5.六聚核苷酸混合物

6.标记用混合底物 此管内有50μl10倍浓度的dNTP标记用混合底物,含dATP(1mmol/L)dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。

7.DNA聚合酶Ⅰ大片段(标记级) 此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow),2U/μl。

8.(Dig)AP结合物 此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段,结合有碱性磷酸酶750U/ml。

9.NBT 有两管,每管1.25ml,是溶于70%(V/V)二甲基甲酰胺的硝基蓝四唑盐溶液(75mg/ml)。

10.X-磷酸盐 有两管,每管0.9ml,是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐的甲苯胺溶液(50mg/ml)。

11.封阻试剂 有两瓶,每瓶有50g粉剂。

(三)需配制的溶液

EDTA(0.2mol/L),pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇;Tris-HCl(10mmol/L);ED-TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸钠盐;10%(V/V)SDS;20×SSC:3mol/l NaCl;0.3mol/L柠檬酸三钠;pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

(四)操作方法

1.标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3μg线性的DNA,也可标记更大量的DNA,但所有的成分和体积要相应增加。

(1)DNA探针热变性,煮沸10min,迅速冷却于冰/乙醇中5min以上,待用。

(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及试剂:

新鲜变性的DNA 1-3μg

六聚核苷酸混合物 2μl(管5)

dNTP标记用混合底物  2μl(管6)

加无菌重蒸水至  19μl

DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow) 1μl(管7)

(3)在37℃保温至少60min,可到20h。

(4)煮沸5min,终止反应。

(5)15000rpm离心30s,置于冰上待用。

2.预杂交 按100cm2膜用20~40ml预杂交溶液,预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成:5×SSC

0.5%(W/V)封阻试剂(管11)

0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

膜放入塑料袋,灌入预杂交液,排除气体后密封,在65℃预杂交过夜。

3.杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液,杂交时偶尔摇动杂交袋,使里面的溶液重新分配。

杂交液组成: 50%甲酰胺(V/V)

5%(W/V)封阻试剂

5×SSC

0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

新变性标记DNA(150ng/ml)

杂交液取代预杂交液,替换间膜不能干,成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜(16~20h)。

4.洗膜按100cm2膜用250ml洗膜液计算。

(1)在室温下用2×SSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。

(2)在65℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。

(3)在室温下用2×SSC溶液漂洗1次。

5.免疫测定

(1)配制溶液

缓冲液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

缓冲液2:0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50~70℃,此溶液保持混浊)。

缓冲液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

缓冲液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

显色溶液:新鲜配制,在10ml缓冲液3中,加45μlNBT溶液(管9)和35μlX-磷酸盐缓冲液(管10)。

2. 显色过程

A.膜在缓冲液1中短暂洗涤(1min)。

B.在100ml缓冲2中保温30min。

C.再用缓冲液1短暂洗涤。

D.用缓冲液1稀释的抗体结合物(管8)至150U/L(1:5000);稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。

E.膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。

F.用100ml缓冲液1洗膜,以除去未结合的抗体结合物,15min,2次。

G.膜在缓冲液3中平衡2min。

H.在黑暗条件下,膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内,几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。当颜色显影时,不可振荡或搅拌。

I.当要求的点或带已被检测时,可用50ml缓冲液4洗膜5min终止反应。

J.摄相。

说明:上述各反应均在室温下进行,除了显色反应外,均需振荡或搅拌。

(五)排除实验中问题的方法

1.DNA不能有效地被标记时考虑

(1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀,重新纯化DNA。

(2)标记反应的保温时间延长(增至20h)。

(3)DNA变性或许不完全,这时对大片段DNA特别重要。

2.不能达到预期的灵敏度时考虑

(1)DNA标记率。

(2)增加标记DNA的浓度或增加杂交时间。

(3)显色反应的时间可延长至3d。

3.若显色时背景过深,可采取

(1)在杂交溶液中减少标记DNA量。

(2)增加杂交溶液的体积,使膜随意漂浮在溶液中。

(3)某些类型的尼龙膜可能产生深色背景,因此可采用其它类型的尼龙膜或改用硝酸纤维素膜。

(4)在杂交和检测过程中增加封阻试剂的浓度。

四、核酸的分子杂交

核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上,然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术,转移技术及其它常用的杂交技术。

(一)斑点杂交的直接点样法

斑点杂交或叫打点杂交(dot-blot hybridization),其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品,操作简便,灵敏度高。一个点样品只含0.25~1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小(碱基对数)。

1.DNA的打点法(DNa Dot Blot)

(1)膜的处理:戴上干净手套,取出硝酸纤维膜,按需要剪成一定大小,量好各样点间距离,用软铅笔标记。

(2)DNA变性:将DNA溶液于1×TE(pH8.0)缓冲液中或蒸馏水中,取一定量DNA样品加于小塑料管中,在100℃沸水中煮10min,迅速入冰水中。

(3)点样:用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1~5μl变性DNA,将滴管放在硝酸纤维膜上,使DNA慢慢吸在滤膜上,点样完后凉干。

(4)固定:将凉干的滤膜夹在滤纸中,于80℃干烤2~3h,然后进行杂交。

2.RNA的打点法(RNa Dot Blot)

(1)膜的处理:同DNA的打点法。

(2)RNA变性:将提取的RNA与50μl 20×SSC/甲醛(30μl20×SSC加20μl甲醛)混合,65℃水浴15min。

(3)点样:同DNA的打点法。

(4)固定:同DNA的打点法。

(二)DNA的吸印转移法(Southern Blot)

DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后,放入碱性溶液中使其变性,将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上,然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置,而且能测定分子量。

试剂:变性液:0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl

中和液:1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaClpH8.0

20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/l NaCl

1.电泳 取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切,电泳鉴定酶切完全后,取酶消化后的DNA点样于0.8%~1.2%的凝胶上,以0.8~1V/cm电压电泳过夜,在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转,紫外灯照射10~20min后拍照。

2.变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min,将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。

3.转移 取托盘一只,放入10×SSC溶液约500~1000ml,托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃,取一长方形Wateman paper(滤纸)搭在桥上,两边浸入10×SSC溶液中,仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡(用玻棒在滤纸上滚动)。将凝胶放在滤纸上,去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上(如NC膜浸湿不均匀,则考虑更换NC膜,操作时手切勿触及NC膜),去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸(长和宽均比NC膜小1mm)放在NC膜上,仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小,重叠放在滤纸上,再压一重物约500~1000g。转膜24h,中间更换吸水纸。

Southern转膜示意图

图23-7 Southern转膜示意图

4.固定用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶,让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min,取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h,然后将膜封入塑料袋进行杂交。

(三)RNA的吸印转移法(Northern blot)

在RNA凝胶电泳之前,先用乙二醛等变性剂处理RNA,再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂,然后进行杂交。

试剂:

乙二醛:4mol/L(约为30%),经过阴阳离子交换树脂纯化,使pH为5.5~6.0

磷酸缓冲液:80mmol/L pH6.5~7.0

磷酸缓冲液:10mmol/L pH6.5~7.0

Tris-HCl:20mmol/L pH7.8

二甲基亚砜:分析纯

20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/l NaCl

1.RNA变性 吸取1μl 80mmol/L磷酸缓冲液,1μl RNA样品(最多100μg),2μl,4mol/l 乙二醇,4μl二甲基亚砜。混匀后,50℃水浴1h,然后放入冰中。

2.电泳 变性结束后,加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸缓冲液2μl和少量溴酚蓝,混匀后点样于1.0%的凝胶上,以4~5V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液,pH6.5~7.0。

3.转移 变性处理后的RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上,转移过程和转移变性与DNA相同。

4.固定 用20×SSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中凉干后,80℃烤膜2h

5.乙二醛附加物消除 RNA膜固定后,放入20mmol/l Tris-HCl中,100℃处理5~10min,去除乙二醛,然后进行杂交。

(四)硝酸纤维膜固相杂交

核酸样品经过直接点样或转移到硝酸纤维膜上,固定后,可以进行杂交反应。在杂交溶液中,硝酸纤维膜上变性的核酸样品和变性后的探针在一定的条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。

试剂及操作方法见本节 三。

五、真核细胞基因组DNA的制备

从不同组织细胞或血细胞中提取DNA是进行基因诊断的先决条件。制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净,又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA的反应体系中,SDS是离子型表面活性剂,主要作用是:(1)溶解膜蛋白而不破坏细胞膜;(2)解聚细胞中的核蛋白;(3)与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸,使DNA分子尽量完整地分离出来。具体方法如下:

(一)白细胞DNA的制备

(1)采集外周静脉血10ml,加1.7ml ACD(柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2灭菌30min)抗凝。

(2)将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内,加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2、1%Triton –X 100],轻轻上下振荡至透明,红细胞完全溶解。

(3)冰浴10min,离心,3000rpm,10min。弃上清,STMT重复处理1~3次。

(4)弃上清,白色沉淀物加10mlSTE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)],先少量,充分混匀,然后加10mg/ml蛋白酶K100μl,20%SDS30μl,摇匀,置37℃水浴15~20h。

(5)用等体积饱和酚抽提,3000rpm离心5min。

(6)用大口钝缘吸管小心吸取上层水相,加饱和酚和氯仿-异戊醇(24:1)抽提,3000rpm离心5min 。

(7)小心吸取上层水相,用等体积氯仿-异戊醇(24:1),抽提,3000rpm离心5min。

(8)小心吸取上层水相,加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀,-20℃过夜。

(9)将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出,放入Eppendorf管内,加1ml 75%乙醇4℃静置1h,离心,10000rpm10min。

(10)弃上清,用蜡膜将管口封好,针刺数个小孔,真空抽提(10~15min)。

(11)加200μl1×TE溶解,置4℃保存。

(12)对所提DNA用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。

(13)取2~4μl DNA样品,经琼脂糖凝胶(Agarose)电泳,检查所提DNA的质量及降解情况。

(二)组织DNA的制备

(1)将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎,加4ml 1×RSB缓冲液(10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/lNaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml带盖的塑料管中。

(2)加SDS至浓度为1%(可加0.4ml10%SDS),混匀。由于DNA从核中释放出来,样品变得粘稠。

(3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl,终浓度为100μl/ml,37℃保温1~3d,直到组织完全解体。中间可振动样品管几次。加0.4ml 5mol/L NaCl。

(4)用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇(24:1)各抽提一次,3000rpm离心5min,用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。

(5)加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段DNA,并移入一新管,吸干DNA中的无水乙醇。

(6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中,4℃过夜可作进一步纯化。

(7)加20μlRNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。加0.4ml5mol/L NaCl。

(8)同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提,乙醇沉淀离心,弃上清。

(9)75%乙醇洗涤2次,离心,弃上清,真空抽干。适量1×TE溶解,保存在4℃。

六、转移基因

最常用的将克隆重组的DNA片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。转染的DNA可能是通过吞饮作用进入细胞质,然后进行细胞核。

(1)配制下列溶液

①2×HEPES-缓冲盐溶液(HBS)

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌,分装贮存于4℃。

④DNA:将DNA(约20μg/106细胞)溶于0.1×TE(pH8.0),使用浓度为40μg/ml。为使转化效率达到最高,质粒DNA应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。如果所用DNA量较少,应加入载体DNA将DNA浓度调至40μg/ml。实验室制备的真核载体DNA转染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鲑鱼精DNA高。载体DNA用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。

(2)转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞,以1~2×105细胞/cm2的密度重新种入60mm组织培养皿中。在37℃、5%~7%CO2及一定湿度的培养箱中培养20~24h。

(3)每转染一个60mm培养皿中的单层细胞,须依如下方法制备磷酸钙-DNA共沉淀物:取步骤一所制备的DNA[40μg/ml,溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中,缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙(温和混合30s左右)。于室温育20~30min,其间将形成细小沉淀。温育结束时,用吸管将混合液吹打一次,使沉淀物悬浮。

通常采用的另一方案是将氯化钙和DNA的稀释混合液加入2×HBS溶液中,逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙(250mmol/L)的DNA。按照前述方法温育之。

如果需要转染更为大量的细胞,上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。如果体积翻两番,则须使用更大的塑料管,一般在25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上,可将0.5ml磷酸钙-DNA共沉淀物加入5ml培养液中,而在90mm细胞培养皿上,一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。

已经发表的方案中,混合各组分的方式与速率大不相同。其中有一些认为除了温和振摇之外,其它措施均无济于事,并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。其它一些方案则规劝在加入DNA溶液时连续而缓慢地混匀,然后再温和振荡。其目的是为了避免急速形成粗沉淀物,以致降低转化效率。实际上,除了混合的速度之外,还有其它若干因素包括DNA的浓度和大小(让高分子量DNA从细针头中通过,可将之剪切变小)、缓冲液的精确pH(有些工作者配制了几批pH范围从6.95至7.1不等的HBS缓冲液,逐批试验沉淀物的质量及转染效率)。如果必须使转染效率达到最高,就要花时间针对特定的系统优化上述几种因素。一旦得到一批灵验的试剂,只需依照前面方法进行配制和贮存,即可在长期内获得可重复的结果。

(4)将磷酸钙-DNA悬液转移至细胞单层上的培养液中[在60mm培养皿中,可将0.5ml悬液加入5ml培养液中],轻轻左右晃动一下培养皿使培养液得以混合,此时可见培养液成黄橙色浑浊状。另一方法是吸出培养液,直接把沉淀物加到细胞上,将细胞置于室温温育15min,然后再将培养液加回到培养皿中,此时细胞上有许多细小颗粒。采用以上两种方法,都要在37℃、5%~7%CO2及一定湿度的培养箱中将转染细胞培养长达24h[时间的长短取决于后续处理步骤的不同,见步骤(5)]。

(5)然后,转染细胞可依以下任一种方法处理:

①如果不进行其它处理(如用氯喹、甘油或丁酸钠等试剂处理,见后),可在细胞培养16~24h后,吸出培养液和沉淀物,用PBS将单层细胞再洗一次。然后按下述③d操作。

②在许多情况下,同时用氯喹处理细胞,可提高DNA摄入率。氯喹可能是通过抑制溶酶体水解酶类对DNA的降解而起作用的。氯喹浓度及其处理时间不能超越细胞对其毒性作用的耐受能力。因此必须通过预实验来决定适于所用特定型别细胞的最佳氯喹浓度。但对于大部分型别的细胞,用终浓度为100μmol/L的氯喹处理3~5h,都可取得良好效果。可在磷酸钙-DNA共沉淀物加入细胞之前或之后(见步骤(4)介绍的其它方法),直接将氯喹二磷酸贮存液(过滤除菌并贮于-20℃用金属泊密封的管中,100mmol/L)稀释(1:100)于培养液中。在氯喹处理过程中,细胞呈现泡状是正常的。经用DNA和氯喹处理3~5h后,弃去培养液和沉淀,用PBS洗,然后按下述d操作。

③用甘油短暂处理细胞,同样可提高转化效率或导入DNA的瞬时表达水平。这一步骤可以在氯喹处理之后进行。由于不同细胞对甘油的毒性作用的敏感性相差悬殊,因此每种型别的细胞都必须通过预实验决定最佳处理时间(从30s至3min)。耐受甘油的细胞可以暴露于含磷酸钙-DNA共沉淀物(含或不含氯喹)的生长液3~5h后进行休克

a. 吸出生长液,用PBS将单层细胞洗1次;

b.在单层细胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油,在37℃培养0.5~3min;

c.吸出甘油,用PBS将单层细胞洗1次;

d.加入5ml预加温的完全生长液,放入培养箱中继续培养24~60h后,检测DNA的瞬时表达或将细胞重新种入适当的选择性培养基中,分离稳定的转化体。

④业以表明,丁酸钠也可以在猴源和人源细胞中增强带SV40早期启动子/增强子的重组质粒的表达。可直接在生长液中加入有关试剂,也可以使经过甘油休克的细胞接受丁酸钠处理。须视细胞型别的不同,采用不同浓度的丁酸钠(500mmol/L贮存液,在化学通风橱中用NaOH中和丁酸制备而成),例如:

CV-110mmol/L

NIH-3T3 7mmol/L

HelaS3 5mmol/L

CHO 2mmol/L

不加完全生长液,然后重复步骤d。

(6)转移基因表达和细胞集落形成

①瞬时表达:在转染后48~60h收获细胞,进行RNA或DNA杂交分析。新合成的蛋白质可以用放射免疫测定Western印迹,体内代谢标记-免疫沉淀或者细胞提取液中酶活性的测定等方法来进行分析,如果测定中有重复品或者转染细胞要经过多种不同条件或在一段时间历程以内取不同时间进行处理,就要避免皿与培养皿之间转染效率的偏差。在这些情况下,最好转染大片的单层细胞(90mm培养皿),培养24h后用胰蛋白酶进行消化,再分接到若干较小的培养皿上。

②稳定转化:在非选择性培养基中培养18~24h,使所转移基因得到表达之后,用胰蛋白酶消化细胞,种入适当的选择性培养基中。这种培养基在2~3周内每2~4d须更换1次,以便除去死细胞残骸并使抗性细胞集落得以生长。

可以克隆单个细胞集落,增殖后进行测定。可以用冰预冷的甲醇将仍保留在培养皿内的细胞固定15min,再于室温用10%Giemsa染色15min,最后用自来水冲洗,这样即可得到细胞集落数的永久记录。Giemsa染液可用PBS或水现用现配,并用Whatman 1号滤纸过滤。

重新接种细胞以便取得分隔良好的细胞集落所要求稀释倍数,主要由稳定转化的效率来决定。这一效率可以相差若干个数量级,它起决于:a.受体细胞的型别(即使同一细胞系,克隆不同或传代数不同,也表现出显著差异);b.导入基因的特性及其转录调控信号强弱;c.转染中所用供体DNA的量。

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