第三节 DNA的损伤与修复

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DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息,因此维护DNA分子的完整性对细胞至关重要。外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变,而且与RNA及蛋白质可以在胞内大量合成不同,一般在一个原核细胞中只有一份DNA,在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对,如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正,对体细胞就可能影响其功能或生存,对生殖细胞则可能影响到后代。所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要,也是生物能保持遗传稳定性之所在。在细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA,反映了DNA对生命的重要性。另一方面,在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象,DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的,正因为如此生物才会有变异、有进化。

一、DNA的损伤

(一)DNA损伤的原因

1.DNA分子的自发性损伤

(1)DNA复制中的错误 以DNA为模板按碱基配对进行DNA复制是一个严格而精确的事件,但也不是完全不发生错误的。碱基配对的错误频率约为10-1-10-2,在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10-5-10-6,复制过程中如有错误的核苷酸参入,DNA聚合酶还会暂停催化作用,以其3′-5′外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸,然后再继续正确的复制,这种校正作用广泛存在于原核和真核的DNA聚合酶中,可以说是对DNA复制错误的修复形式,从而保证了复制的准确性。但校正后的错配率仍约在10-10左右,即每复制1010个核苷酸大概会有一个碱基的错误。

(2)DNA的自发性化学变化 生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化,至少有以下类型:

a.碱基的异构互变 DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化(例如烯醇式与酮式碱基间的互变),这种变化就会使碱基配对间的氢键改变,可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等,如果这些配对发生在DNA复制时,就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤,如图16-18所示。

腺嘌呤的稀有互变异体与胞嘧啶

图16-18 腺嘌呤的稀有互变异体与胞嘧啶

(a),或胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤

(b)的氢链形成导致下一世代中G-C配对取代A-T配对

b.碱基的脱氨基作用 碱基的环外氨基有时会自发脱落,从而胞嘧啶会变成尿嘧啶、腺嘌呤会变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤会变成黄嘌呤(X)等,遇到复制时,U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个。

c.脱嘌呤与脱嘧啶 自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来。一个哺乳类细胞在37℃条件下,20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个、嘧啶约500个:估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞(如神经细胞)在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108,约占细胞DNA中总嘌呤数的3%。

d.碱基修饰与链断裂 细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤,能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物,还可能引起DNA单链断裂等损伤,每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次。此外,体内还可以发生DNA的甲基化,结构的其他变化等,这些损伤的积累可能导致老化。

由此可见,如果细胞不具备高效率的修复系统,生物的突变率将大大提高。

2.物理因素引起的DNA损伤 射线引起的DNA损伤是最引人注意的。

胸腺嘧啶二聚体的形成

图16-19 胸腺嘧啶二聚体的形成

(1)紫外线引起的DNA损伤 DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的。当DNA受到最易被其吸收波长(~260nm)的紫外线照射时,主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体,相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环(cyclobutane ring)连成二聚体,其中最容易形成的是TT二聚体,如图16-19所示。

人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5×104/细胞,但只局限在皮肤中,因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后,就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。

(2)电离辐射引起的DNA损伤 电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应,直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤,间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。电离辐射可导致DNA分子的多种变化:

a.碱基变化 主要是由OH-自由基引起,包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。

b.脱氧核糖变化 脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应,导致脱氧核糖分解,最后会引起DNA链断裂。

c.DNA链断裂 这是电离辐射引起的严重损伤事件,断链数随照射剂量而增加。射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而致DNA链断裂。DNA双链中一条链断裂称单链断裂(single strand broken),DNA双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂(doublestrand broken)。虽然单链断裂发生频率为双链断裂的10-20倍,但还比较容易修复;对单倍体细胞来说(如细菌)一次双链断裂就是致死事件。

d.交联 包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联。同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合,DNA与蛋白质之间也会以共价键相连,组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与DNA共价键连接。这些交联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础,会影响细胞的功能和DNA复制。

3.化学因素引起的DNA损伤

化学因素对DNA损伤的认识最早来自对化学武器杀伤力的研究,以后对癌症化疗、化学致癌作用的研究使人们更重视突变剂或致癌剂对DNA的作用。

(1)烷化剂对DNA的损伤 烷化剂是一类亲电子的化合物,很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应。烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤:

a.碱基烷基化。烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上,其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击,烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化,例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对,而改与胸腺嘧啶配对,结果会使G-C转变成A-T。

b.碱基脱落。烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定,容易脱落形成DNA上无碱基的位点,复制时可以插入任何核苷酸,造成序列的改变。

c.断链。DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷化,结果形成不稳定的磷酸三酯键,易在糖与磷酸间发生水解,使DNA链断裂。

d.交联。烷化剂有两类,一类是单功能基烷化剂,如甲基甲烷碘酸,只能使一个位点烷基化;另一类是以双功能基烷化剂,化学武器如氮芥、硫芥等,一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等,某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类,其两个功能基可同时使两处烷基化,结果就能造成DNA链内、DNA链间,以及DNA与蛋白质间的交联。

氮芥引起DNA分子两条链在鸟嘌呤上的交联

图16-20 氮芥引起DNA分子两条链在鸟嘌呤上的交联

(a)交联附近的总图;(b)交联部分结构图

(2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物,如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。由于其结构与正常的碱基相似,进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成,例如5-BU结构与胸腺嘧啶十分相近,在酮式结构时与A配对,却又更容易成为烯醇式结构与G配对,在DNA复制时导致A-T转换为G-C。

还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专一修饰DNA链上的碱基或通过影响DNA复制而改变碱基序列,例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U,经过复制就可使DNA上的G桟变成A桾对;羟胺能使T变成C,结果是A桾改成C桮对;黄曲霉素B也能专一攻击DNA上的碱基导致序列的变化,这些都是诱发突变的化学物质或致癌剂。

(二)DNA损伤的后果

上述损伤会最终导致DNA分子结构的变化,这种DNA分子水平上的突变(mutation)是整体遗传突变的基础。

归纳DNA损伤后分子最终的改变,有以下几种类型:

1.点突变(point mutation) 指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。

2.缺失(deletion) 指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。

3.插入(insertion) 指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数,则发生读框移动(reading frame shift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frameshift mutaion)。

4.倒位或转位(transposition) 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。

5.双链断裂 已如前述,对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。

突变或诱变对生物可能产生4种后果:①致死性;②丧失某些功能;③改变基因型(genotype)而不改变表现型(phenotype);④发生了有利于物种生存的结果,使生物进化。

二、DNA修复

DNA修复(DNA repairing)是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤,只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这修复功能,就无法对付经常发生的DNA损伤事件,就不能生存。所以研究DNA修复也是探索生命的一个重要方面,而且与军事医学、肿瘤学等密切相关。对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应。

(一)回复修复

这是较简单的修复方式,一般都能将DNA修复到原样。

1.光修复 这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶(photolyase)完成,此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体,并与其结合,这步反应不需要光;结合后如受300-600nm波长的光照射,则此酶就被激活,将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体,然后酶从DNA链上释放,DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中,人体细胞中也有发现。

2.单链断裂的重接 DNA单链断裂是常见的损伤,其中一部分可仅由DNA连接酶(ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在,修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。

损伤DNA的切除修复

图16-21 损伤DNA的切除修复

3.碱基的直接插入 DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点,能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合,在K+存在的条件下,催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键,且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对,使DNA完全恢复。

4.烷基的转移 在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶,能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强,但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。

(二)切除修复(excision repair) 是修复DNA损伤最为普遍的方式,对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中,也是人体细胞主要的DNA修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用,基本步骤如图16?1所示,①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点,在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。②由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。③在DNA聚合酶的催化下,以完整的互补链为模板,按5′→3′方向DNA链,填补已切除的空隙。④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。

DNA损伤后重组修复

图16-22 DNA损伤后重组修复

(三)重组修复(recombinational repair)

上述的切除修复在切除损伤段落后是以原来正确的互补链为模板来合成新的段落而做到修复的。但在某些情况下没有互补链可以直接利用,例如在DNA复制进行时发生DNA损伤,此时DNA两条链已经分开,其修复可用图16?2所示的DNA重组方式:①受损伤的DNA链复制时,产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。②另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换,将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处,而母链DNA出现缺口。③以另一条子链DNA为模板,经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口,最后由DNA连接酶连接,完成修补。

重组修复不能完全去除损伤,损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上,只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的,但经多次复制后,损伤就被“冲淡”了,在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。

(四)SOS修复

“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式,修复结果只是能维持基因组的完整性,提高细胞的生成率,但留下的错误较多,故又称为错误倾向修复(errorprone repair),使细胞有较高的突变率。

SOS修复

图16-23 SOS修复

如图16-23所示,当DNA两条链的损伤邻近时,损伤不能被切除修复或重组修复,这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺,再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶桽OS修复酶类,催化空缺部位DNA的合成,这时补上去的核苷酸几乎是随机的,但仍然保持了DNA双链的完整性,使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。

应该说目前对真核细胞的DNA修复的反应类型、参与修复的酶类和修复机制了解还不多,但DNA损伤修复与突变、寿命、衰老、肿瘤发生、辐射效应、某些毒物的作用都有密切的关系。人类遗传性疾病已发现4000多种,其中不少与DNA修复缺陷有关,这些DNA修复缺陷的细胞表现出对辐射和致癌剂的敏感性增加。例如着色性干皮病(xerodermapigmentosum)就是第一个发现的DNA修复缺陷性遗传病,患者皮肤和眼睛对太阳光特别是紫外线十分敏感,身体暴光部位的皮肤干燥脱屑、色素沉着、容易发生溃疡皮肤癌发病率高,常伴有神经系统障碍,智力低下等,病人的细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低。

小结

环境和生物体内的因素都经常会使DNA的结构发生改变。DNA的复制会发生碱基的配对错误;体内DNA会有自发性结构变化,包括DNA链上的碱基异构互变、脱氨基、碱基修饰、DNA链上的碱基脱落等。外界射线的照射等物理因素,烷化剂、碱基类似物、修饰剂等化学因素都能损伤DNA的结构,变化包括有相邻嘧啶共价二聚体的形成、碱基、脱氧核糖和磷酸基团的烷基化和其它修饰、碱基脱落、DNA单链断裂、双链断裂、DNA链内交联、链间交联、DNA与周围的蛋白质交连等。最后能导致DNA的点突变、DNA核苷酸的缺失、插入或转位、DNA链的断裂等,结果可能影响生物细胞的功能和遗传特性,这些改变可能会导致细胞死亡、也有机会使细胞获得新的功能或进化,也可能细胞只有DNA结构的遗传性改变而没有表型变化,视DNA结构变化的部位、类型和范围不同而异。

生物在进化过程中获得的DNA修复功能,对生物的生存和维持遗传的稳定性是至关重要的。对有些DNA的损伤,细胞能将其完全修复到原样,如可将嘧啶二聚体切开、DNA单链断裂可重新连接、碱基缺失可再配对插入、加成的烷基可以移除、一条链上的碱基或核苷酸的错误可以切除并依赖互补链作模板而复制重新修复等。对DNA较严重的损伤,细胞可采取重组修复、SOS修复等方式进行反应,以期提高细胞的存活率,但不能完全消除DNA的损伤,会带给细胞较高的突变率。

DNA的损伤和修复与遗传、突变、寿命、衰老、辐射效应、肿瘤发生、某些毒剂的作用、以及某些遗传性疾病等有密切的关系。目前对DNA损伤修复的认识还不透彻。

复习思考题

1.为什么说细胞对DNA损伤的修复能力对细胞的生存是至关重要的?

2.体内那些因素会导致DNA结构的变化?细胞能采取那些办法保持DNA结构的稳定性?

3.那些环境因素容易损伤生物体内的DNA?损伤有那些方式和类型?结果对生物细胞会有些什么影响?

4.现在所知生物细胞对DNA损伤修复有那些方式?修复反应的结果会如何?

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