第二节 反转录作用(reverse transcription)

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1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶,该酶以RNA为核板,根据碱基配对原则,按照RNA的核苷酸顺序(其中V与A配对)合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反,故称为反转录,催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中,哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶。

反转录酶的作用是以dNTP为底物,以RNA为模板,tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物,在tRNA3′桹H末端上,按5′→3′方向,合成一条与RNA模板互补的DNA单链,这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA),它与RNA模板形成RNA桪NA杂交体。随后又在反转录酶的作用下,水解掉RNA链,再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此,完成由RNA指导的DNA合成过程(图16-17)。

反转录酶催化的反转录作用

图16-17 反转录酶催化的反转录作用

携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒,它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠反转录酶催化合成DNA,随后这种DNA环化并整合到宿主细胞的染色体DNA中去,以原病毒(provirus)的形式在宿主细胞中一代代传递下去。以后又发现许多反转录病毒基因组中都含有癌基因(oncogene),如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞。(将在专门一章中叙述)。

大多数反转录酶都具有多种酶活性,主要包括以下几种活性。①DNA聚合酶活性;以RNA为模板,催化dNTP聚合成DNA的过程。此酶需要RNA为引物,多为色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此没有校正功能,所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高。②RNase H活性;由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子,将由RNaseH从RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指导的DNA聚合酶活性;以反转录合成的第一条DNA单链为模板,以dNTP为底物,再合成第二条DNA分子。除此之外,有些反转录酶还有DNA内切酶活性,这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用,目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板,在反转录酶的作用下,合成出互补的DNA(cDNA),由此可构建出cDNA文库(cDNa library),从中筛选特异的目的基因,这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法,详见基因工程一章。

小结

DNA是携带遗传信息的载体,细胞分裂前,通过DNA的复制作用,遗传信息从亲代DNA分子传到子代DNA分子中。DNA复制时,是从一个特定的起始点开始的,两条DNA链分别做模板,在DNA聚合酶等许多酶和蛋白质分子的参与下,以四种脱氧单核苷酸为原料(dNTP),以碱基配对为原则合成新一代的DNA分子,合成方向是5′→3′。经过复制后的DNA分子中,一条链来自亲代DNA分子,另一条链是新合成的,这种复制方式叫做半保留复制。由于DNA分子复制时,两条链分别做模板,有一条链是连续合成的,这条链为前导链,而另一条链合成时只能以5′→3′方向先合成岗崎片段,然后再靠连接酶将这些片段连接起来,形成随从链,所以DNA复制是半不连续的合成。

DNA复制时,先要由DNA拓扑异构酶作用于DNA分子双螺旋,使之松驰,然后才能由解链酶作用,解开双链,此时引物酶合成一段RNA分子做为引物,在DNA聚合酶Ⅲ催化下,连续地合成DNA链。随从链的合成靠多种酶和蛋白质因子参与,在引物酶作用下合成RNA引物,在DNA聚合酶Ⅲ作用下合成DNA片段,它们共同形成了岗崎片段,RNA引物是靠DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切活性切除的,切除引物后的空隙,再靠DNA聚合酶Ⅰ填补,最后在连接酶作用下,形成长链。

真核生物中DNA的复制靠DNA聚合酶,它有多种不同的形式(α、β、γ、δ等)此外,还有像PCNA等多种蛋白质因子参与。

DNA复制中的准确性很高,因为原核细胞靠DNA聚合酶Ⅰ而真核细胞靠DNA聚合酶δ,都具有3′→5′外切酶活性,可以校正复制中出现的碱基错配。DNA的合成也可以靠反转录酶的催化而完成,这是以RNA分子为模板,合成DNA分子的过程,在致癌的RNA病毒中,有反转录酶的存在,真核生物中的端粒酶就是一种反转录酶,它催化染色体端区DNA的合成。

思考题

1.DNA复制起始有哪些特点?

2.原核生物与真核生物中的DNA聚合酶有哪些种类,它们各自的功能是什么?

3.DNA复制时前导链与随从链的合成有哪些不同?

4.DNA拓扑异构酶的作用如何?

5.连接酶催化的连接反应与DNA聚合酶5′→3′聚合活性有何异同?

6.什么是反转录,有什么生物学意义?

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