第二十章 脱落细胞检查技术

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脱落细胞检验医生除要熟练掌握细胞形态学特点外,还必须掌握各项操作和染色技术及观察方法,所以脱落细胞学检查技术是重要的学习内容之一。它包括标本采集、制片、固定和染色、镜下观察方法及诊断要领等。

第一节 标本采集和涂片制作方法

一、标本采集

正确地采集标本是细胞学诊断的基础和关键之一,故要准确地选择部位,尽可能在病变区直接采集细胞。采集的标本必须保持新鲜,尽快制得,以免细胞自溶或腐败。尽可能避免血液、粘液等混入标本内,采集方法应简便,操作轻柔,避免病人痛苦和引起严重并发症及促进肿瘤扩散,下面介绐几种常用的标本采集方法。

(一)直视采集法

外阴、阴道、阴道穹窿、宫颈、口腔、肛管、鼻腔、鼻咽部、眼结膜及皮肤等部位,可以直接用刮片刮取、吸管吸取、刷洗、食管、胃、直肠、气管和肺内支气管则使用纤维内镜在病灶处直接刷取细胞制片。

(二)自然分泌液的采集法

1.痰液涂片检查:痰兴高采烈为支气管等呼吸的分泌物,对支气管肺癌和其它呼吸道疾病细胞学诊断具有重要价值。

2.尿液涂片检查:收集尿液中脱落的泌尿道细胞成分,作泌尿道肿瘤和某些疾病的细胞学诊断。

3.乳头溢涂片检查:用于导管内乳头状瘤和乳腺癌细胞学检查。

4.前列腺液涂片检查:采用前列腺按摩法取得分泌物,作前列腺细胞学诊断。

(三)灌洗洗

向空腔器官或腹腔、盆腔(剖腹探查时)灌注一定量生理盐水冲洗,使其细胞成分脱落于液体中,收集灌洗液离心制片,作细胞学检查。

(四)磨擦法

利用磨擦工具在病变部位磨擦,将擦取物直接涂片。常用磨擦工具有海棉磨擦器、线网套、气囊等。可分别用于鼻咽部、食管和胃部病灶的取材。

(五)针穿抽吸法

当有胸腔、腹腔、心包腔及关节腔积液时,可用针穿抽吸部分积液作细胞学检查。此外某些深部组织器官,如淋巴结、甲状腺、软组织、肝等亦可作细针穿刺吸取部分细胞进行涂片诊断。

二、涂片制作方法

(一)涂片前准备工作及涂片方法

1.涂片前准备工作

(1)保证标本新鲜,取材后尽快制片。

(2)涂操作要轻巧,避免挤压以防止损伤细胞。涂片要均匀,厚薄要适度,太厚细胞堆叠,太薄细胞过少,均影响诊断。

(3)玻片要清洁无油渍,先用硫酸洗涤液浸泡冲洗,再用75%乙酸浸泡。

(4)含蛋白质的标本可直接涂片,缺乏蛋白质的标本,涂片前先在玻片上涂薄层粘附剂,以防止染色时细胞脱落,常用粘附剂为蛋白甘油,由等量生鸡蛋白和甘油混合而成。

(5)每位患者的标本至少涂两张玻片,以避免漏诊。涂片后立即在玻片一端标上编号。

2.涂片制备方法

(1)推片法:用于稀薄的标本,如血液,胸、腹水等。取离心后标本一小滴滴在玻片偏右侧端,用推片用30度夹角将玻片上检液轻轻向左推。

(2)涂抹法:适用于稍稠的检液,如鼻咽部标本。用竹棉签在玻片上涂布,由玻片中心经顺时针方向外转圈淫抹;或从玻片一端开始平行涂抹,涂抹要均匀,不宜重复。

(3)压拉涂片法:将标本夹于横竖交叉的两张玻片之间,然后移动两张玻片,使之重叠,再边压边拉,获得两张涂片。该法适用于较粘稠标本,如痰液。

(4)吸管推片法:用吸和将标本滴在玻片一端,然后将滴管前端平行置于标本滴上,平行向另一端均速移动滴管即可推出均匀薄膜。此法亦适用于胸、腹水标本。

(5)喷射法:用配细针头的注射器将标本从左至右反复均匀地喷射在玻片上,此法适用于各种吸取的液体标本。

(6)印片法:将切取的病变组织用手术切开,立即将切面平放在玻片上,轻轻按印。此方法为活体组织检查的辅助方法。

(二)涂片的固定

固定(fication)的目的是保持细胞自然形态,防止细胞自溶和细菌所致的腐败;固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破下细胞内溶酶体酶,使细胞不但保持自然形态,而且结构清晰,易于着色。因此标本愈新鲜,固定愈及时,细胞结构愈清晰,染色效果愈好。

1.固定液:细胞学检查常用的固定液有下列三种:第一种乙醚酒清固定液:该固定液渗透明性较强,固定效果好适用于于一般细胞学常规染色;二种是氯仿酒精固定液:又称卡诺氏固定液。其优点同上;第三种95%酒精固定液:适用于大规模防癌普查。制备简单。但渗透作用稍差。

2.固定方法

(1)带湿固定:涂片后未待标本干燥即行固定的方法称带湿因定。此法因定细胞结构清楚,染色新鲜。适用于巴氏或HE染色。痰液、阴道分泌物及食管拉网涂片等常任常用此方法。

(2)干燥因定:涂片后未待其自然干燥,再行固定。适用于稀薄标本如尿液、胃冲洗液等,也适用于于瑞特染色和姬姆萨染色。

3.固定时间:一般为15-30min。含粘液较多标本,如痰液、阴道分泌物、食管拉网等因定时间在适当延长;尿液、胸、腹水等涂片不含粘液,固定时间可酌情缩短。

(三)涂片的染色

1.染色的目的和原理:染色的日的是借助于一种或多种染料,使组织和细胞内结构分别着不同的染色,这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构,作出正确判断。

组织细胞染色原理至今尚无满意的解释,可能是物理作用,也可能是化学作用,或者是两者综合作用的结 果。

染色的物理作用是利用毛细管现象,渗透、吸收和吸附作用,使染料的色素颗粒牢固地进入组织细胞,并使其显色。

染色的化学作用是渗入组织细胞的染料与其相应的物质起化学反应,产生有色的化合物。

各染料都具有两种性质,即产生颜色;征收被组织形成亲和力。这两种性质主要由发色基因和助色基因所产生的。

发色基团:苯的衍生物具有可见光区吸收带。这些衍生物显不的吸收带与其价键的不稳定性有关,如对苯二酚为无色,当其氧化后失去两个氢原子,它的分子或则变为有黄色的对醌,这种产生颜色的醌式环称为发色基团。若一种化合物含有几个环,只要其中有一个醌式环就会发出颜色,称此发色基团为色原(chromogen).

助色基团:是一种能使化合物以生电离作用的辅助原子团(酸碱性基团)。它能使染色的色泽进一步加深,并使其与被染色组织具有亲和力。

助色基团的性质决定染料是酸性碱性。碱性染料具有碱性助色基团,在溶媒中产生的带色部分为带正电荷的阳离子,吻与组织细胞内带负电荷的物质结合而显色。如细胞核内的主要化学成分脱氧化核糖核酸易被苏木素染成紫蓝色,称嗜碱性。酸性染料具有酸性用力色基团,在溶酶中产生带色部分为阴离子,易与组织细胞内带正电荷部分结合而显色,此性质被称为嗜酸性,如细胞浆内订成分为蛋白质,易与伊红或橘黄结合呈红色或橘黄色。

2.常用染色方法:临床日常工作中较为常用的染色方法有下列3种:

(1)巴氏染色法:本法染色特点是细胞具有多色性颜色,色彩鲜艳多彩。涂片染色的透明性好,胞质颗粒分明,胞核结构清晰,如鳞状上皮过度角化细胞胞质呈橘黄色;角化细胞显粉红色;而角化前细胞显浅绿色或浅蓝色,适用于上皮细胞染色或观察阴道涂片中激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序比较复杂。

(2)苏木精—伊红(hemotoxylin eosin,HE)染色法:该方法染色透明度好,核与胞质对比鲜明。染色步骤简便,效果稳定。适用于痰液涂片,觖质核呈紫蓝色,胞质淡玫瑰红色,红细胞呈淡朱红色。

(3)瑞特—吉姆萨染色法(wrightgiemsa atain);本方法多用于血液,骨髓细胞学检查。胞质内颗粒与核安危质结构显示较清晰。操作简便。

第二节 涂片的观察与诊断

一、涂片观察的方法

为提高诊断率和防止造成差错,检查涂片前必须严格核对涂片编号,了解送检单上填写的全部资料;阅片要全面、认真、细心观察。

因涂片中细胞成分分布极为分散,所以显微镜观察时必须按顺序视全张涂片,用推进器从左至右。自上而下移动,仔细观察每一个视野,归后将盖片边缘亦做仔细检查,经防止漏诊(图20-1)。

观察切片的移动法

观察切片的移动法

图20-1 观察切片的移动法

A错误的玻片移动法

B正确的玻片移动法

涂片细胞学检查十分重视低倍观察,先宏观涂片中各种细胞成分,发现异常细胞时,再转换高倍视野,仔细观察细胞结构,明确性质,做出正确诊断。

二、提高细胞学诊断率的要领

(一)细胞学诊断的书写方式

细胞学检查癌细胞的诊断方式分为直接法和分级法。

1.直接法:根据细胞学检查结果,直接写出关于疾病的诊断如痰抹片检查结果为“俩支气管鳞癌”。

2.分级法:将涂片中细胞学检查发现的细胞变化,用分级方式表示。它的优点是能真实地反映细胞学所见。较这客观。目前有三级、四级、和五级三种分类方法。五级分类法过于繁琐,实际应用中较难掌握。因此国内仍常用三级或四级分类法,该两种分类法较为简单明确,易于掌握,能够更准确地反映涂片的本质。

(1)三级分类法:将细胞学检查结果分为阴性,可疑和阳性三级。

Ⅰ级:阴性:无核异质细胞,涂片中均为正常细胞或一般退变细胞。

Ⅱ级:可疑。涂片中发现核异质细胞,但不能肯定的是肿瘤细胞,应重复送检。

Ⅲ级:阳性。涂片中发现典型癌细胞,有时根据癌细胞形态特征及分布,初步进行分类。

(2)四级分类法:将细胞学检查结果分为阴性、核异质,可疑和阳性四级。

Ⅰ级:阴性。

Ⅱ级:核异质。涂片中发现少量核异质细胞,由高度炎症增生所致。

Ⅲ级:可疑。涂片中见重度核异质细胞,其形态基本符合恶性肿瘤细胞标准,但数量过少,还不能完全排除癌前期病变或高度炎症坟生的可能,建议临床重复送检。

Ⅳ级:阳性。

(3)五级分类法

Ⅰ级:无核异质细胞。

Ⅱ级:少量轻度核异质细胞,但无恶性证据。

Ⅲ级:有较多重度核异质细胞,但不能肯定为恶性。

Ⅳ级:有大量重度核异质细胞,但仍缺乏典型恶性肿瘤细胞的证据。

Ⅴ级:发现典型恶性肿瘤细胞,根据其细胞形态,作出初步的分类。

(二)提高细胞学诊断的要领

1.熟练掌握病理学:脱落细胞来自组织,所以是病变组织的部分反映,具有踏实的病理学基础,才能对千变万化的脱落细胞形态作出正确的判断。

2.多思考、多比较:涂片中细胞成分,背景成分以及细胞变性程度等每例各不相同,阅片时要分析思考和比较,最好用涂片中某一背景成他,如淋巴细胞或红细胞作标本。

3.密切结合临床:多与临床医生联系,了解临床症状,化验及影像诊断结果,避免盲目性。

4。认识脱落细胞学的局限性:无充分证据,宁可保存守一点。未肯定的报告对临床亦有参考价值。

5.了解各种染色的特性和优缺点因不同染色方法,细胞表现差别很大。

(三)细胞学诊断的误诊原因

细胞学诊断误诊造成临床诊断的错误,以致影响对患者疾病的诊断治疗。误诊形式有假阳性和假阴性两种。前者是在非肿瘤患者涂片中找到所谓的癌细胞;后者是在肿瘤患者涂片内未找到癌细胞。

细胞学检查从取材到最后诊断,任何一个步骤处理不当,均可产生误诊。引起的误诊原因有以下几种:

1.标本取材不当:未取到真有癌细胞部分,如痰液制片时未仔细选择有效病理成分;或患者咳痰方式不对,未采集到支气管深部分泌物等。

2.标本不新鲜:细胞学检查标本必须在采集后1-2小时内涂片,立即固定,以防止细胞自溶。

3.编号错误:会发生误诊嘏造成医疗事故。故送检标本、申请单、涂片、报告单编号后应仔细核对,避免出现差错。

4.细胞污染:涂片在固定和染色过程中,不断有细胞脱落于试剂中,这些细胞有可能粘附在其它患者涂片上而造成误诊,故要经常过滤或现换试剂。

5.观察不仔细或方法不正确而发生的漏误。

6.肿瘤细胞分化好,与正常细胞不易区别。

7.经放疗或化疗后,正常上皮细胞受射线作用,有明显的形态学改变,吻误诊为癌细胞。

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