黄连的抗肿瘤作用

  黄连黄连复方对裸鼠鼻咽肿瘤移植瘤有明显治疗作用。小檗碱体外对艾氏腹水癌及淋巴瘤NK/LY细胞有一定抑制作用。黄连杀伤鼻咽癌细胞的作用主要表现为细胞毒作用,而盐酸小檗碱抗胃癌的作用与促进癌细胞分化有关。小檗碱还能通过抑制癌细胞呼吸,阻碍癌细胞嘌呤和核酸的合成,干扰癌细胞代谢等途径产生抗癌作用。

  1 抗肿瘤作用机制

  黄连及其有效成分可通过细胞毒作用抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强机体免疫功能、调节细胞信号传导、抗氧化、诱导细胞分化等机制发挥抗肿瘤作用。

  Kohji Takara[3]发现黄连提取物对Hela细胞的生长有浓度依赖性抑制作用, 50μg/ml黄连提取物能够显著增加Hela细胞对紫杉醇的敏感性。黄连素在体外亦能以时间和剂量依赖的方式对Hela细胞产生细胞毒作用并诱导其凋亡。

  1.1 诱导细胞凋亡细胞凋亡是多细胞生物体的重要的自稳机制之一,它的异常在肿瘤发病机制中具有重要作用。干预细胞凋亡的手段可望成为肿瘤治疗的新策略。随着研究的不断深入,现已证实肿瘤细胞的迅速生长和扩散转移与细胞凋亡过弱或过强有关,加强对药物诱导肿瘤细胞凋亡及机制的研究,无疑会给肿瘤的防治提供新的思路和途径。大量的研究表明,黄连及其小檗碱、生物碱等有抗肿瘤作用,而能够诱导肿瘤细胞凋亡是其主要机制之一。

  小檗碱在促人结肠癌SW620细胞凋亡的联级反应中起作用,能抑制人结肠癌Lovo细胞增殖,诱导凋亡。诱导凋亡过程中,黄连总碱与小檗碱和阳性药物比较,作用更为明显,其作用显然与黄连总碱中含有其他生物碱有关,提示有必要筛选其他有效成分[4,5]。

  1.2 阻滞细胞周期小檗碱通过抑制周期关键蛋白Cyclin D1,阻滞PG细胞周期进展,使G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期细胞减少从而抑制肺癌PG细胞增殖[6]。不同浓度黄连和小檗碱作用细胞24 h后, G0/G1期细胞明显下降,S期细胞明显升高。两者对CNE-2Z细胞周期阻滞在S期[7]。小檗碱对不同肿瘤细胞周期的阻滞不同,有待进一步研究。

  1.3 酶学机制研究认为,小檗碱具有拓扑异构酶(TOPO)毒性,能够通过抑制细胞周期蛋白,诱导细胞凋亡,抑制环氧酶-2(COX-2)等从而起到一定的药效作用,COX-2在胆汁酸的致癌机制中发挥不可忽视的作用,小檗碱能抑制COX-2 mRNA、蛋白和PPARγmRNA的表达及PGE2合成。小檗碱抗结肠癌作用中可能与通过非PPARγ路径调节COX-2表达有关[5,8,9]。

  不同浓度小檗碱作用于肝癌细胞后细胞膜内的caspase-3蛋白和 mRNA的表达增加。在蛋白酶级联切割活化过程中,caspase-3处于核心位置,不同的蛋白酶分别切割其酶原,使其激活,活化的caspase-3又进一步切割不同的底物,最终使细胞走向凋亡。小檗碱处理SW620细胞可活化capase-3和caspase-8,进而裂解多聚ADP核糖聚合酶(PARP),释放细胞色素c,BID与抗凋亡因子CIAP1、Bcl-2、Bcl-xL的表达显著减少,推测小檗碱在促SW620细胞凋亡的联级反应中起作用,即通过激活JNK/p38途径和诱导活性氧(ROS)产生而起作用[4]。

  1.4 影响癌基因表达Bcl-2是凋亡控制基因,Bcl-2通过抑制诱导凋亡信号而在肿瘤发生中起作用。小檗碱能激活Bcl-2和抑制Bax和caspase-3的表达来抑制高糖高脂诱导的NIT21细胞凋亡[10]。黄连素可通过增强缺氧/ 复氧损伤中的心肌细胞的Bcl-2 蛋白的表达来抑制由缺氧/ 复氧所造成的心肌细胞的凋亡[11]。

  1.5 影响信号通路在很多恶性肿瘤中均发现Cyclin D1过度表达,Cyclin D1已经被确认为一个癌基因。在正常人体组织中,Cyclin D1蛋白呈低水平表达,当Cyclin D1表达失控时,将引起细胞增殖周期失调,导致恶性肿瘤发生。小檗碱能抑制Cyclin D1表达,对Cyclin D1相关信号通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用,对异常激活的AP-1信号通路活性仍有显著的抑制作用,能降低细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun含量,并抑制Cyclin D1基因启动子区与AP-1转录因子的结合,从而抑制Cyclin D1基因的转录水平,降低Cyclin D1的表达[6]。

  黄连及黄连复方对裸鼠鼻咽肿瘤移植瘤有明显治疗作用。小檗碱体外对艾氏腹水癌及淋巴瘤NK/LY细胞有一定抑制作用。黄连杀伤鼻咽癌细胞的作用主要表现为细胞毒作用,而盐酸小檗碱抗胃癌的作用与促进癌细胞分化有关。小檗碱还能通过抑制癌细胞呼吸,阻碍癌细胞嘌呤和核酸的合成,干扰癌细胞代谢等途径产生抗癌作用。

  1 抗肿瘤作用机制

  黄连及其有效成分可通过细胞毒作用抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、增强机体免疫功能、调节细胞信号传导、抗氧化、诱导细胞分化等机制发挥抗肿瘤作用。

  Kohji Takara[3]发现黄连提取物对Hela细胞的生长有浓度依赖性抑制作用, 50μg/ml黄连提取物能够显著增加Hela细胞对紫杉醇的敏感性。黄连素在体外亦能以时间和剂量依赖的方式对Hela细胞产生细胞毒作用并诱导其凋亡。

  1.1 诱导细胞凋亡细胞凋亡是多细胞生物体的重要的自稳机制之一,它的异常在肿瘤发病机制中具有重要作用。干预细胞凋亡的手段可望成为肿瘤治疗的新策略。随着研究的不断深入,现已证实肿瘤细胞的迅速生长和扩散转移与细胞凋亡过弱或过强有关,加强对药物诱导肿瘤细胞凋亡及机制的研究,无疑会给肿瘤的防治提供新的思路和途径。大量的研究表明,黄连及其小檗碱、生物碱等有抗肿瘤作用,而能够诱导肿瘤细胞凋亡是其主要机制之一。

  小檗碱在促人结肠癌SW620细胞凋亡的联级反应中起作用,能抑制人结肠癌Lovo细胞增殖,诱导凋亡。诱导凋亡过程中,黄连总碱与小檗碱和阳性药物比较,作用更为明显,其作用显然与黄连总碱中含有其他生物碱有关,提示有必要筛选其他有效成分[4,5]。

  1.2 阻滞细胞周期小檗碱通过抑制周期关键蛋白Cyclin D1,阻滞PG细胞周期进展,使G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期细胞减少从而抑制肺癌PG细胞增殖[6]。不同浓度黄连和小檗碱作用细胞24 h后, G0/G1期细胞明显下降,S期细胞明显升高。两者对CNE-2Z细胞周期阻滞在S期[7]。小檗碱对不同肿瘤细胞周期的阻滞不同,有待进一步研究。

  1.3 酶学机制研究认为,小檗碱具有拓扑异构酶(TOPO)毒性,能够通过抑制细胞周期蛋白,诱导细胞凋亡,抑制环氧酶-2(COX-2)等从而起到一定的药效作用,COX-2在胆汁酸的致癌机制中发挥不可忽视的作用,小檗碱能抑制COX-2 mRNA、蛋白和PPARγmRNA的表达及PGE2合成。小檗碱抗结肠癌作用中可能与通过非PPARγ路径调节COX-2表达有关[5,8,9]。

  不同浓度小檗碱作用于肝癌细胞后细胞膜内的caspase-3蛋白和 mRNA的表达增加。在蛋白酶级联切割活化过程中,caspase-3处于核心位置,不同的蛋白酶分别切割其酶原,使其激活,活化的caspase-3又进一步切割不同的底物,最终使细胞走向凋亡。小檗碱处理SW620细胞可活化capase-3和caspase-8,进而裂解多聚ADP核糖聚合酶(PARP),释放细胞色素c,BID与抗凋亡因子CIAP1、Bcl-2、Bcl-xL的表达显著减少,推测小檗碱在促SW620细胞凋亡的联级反应中起作用,即通过激活JNK/p38途径和诱导活性氧(ROS)产生而起作用[4]。

  1.4 影响癌基因表达Bcl-2是凋亡控制基因,Bcl-2通过抑制诱导凋亡信号而在肿瘤发生中起作用。小檗碱能激活Bcl-2和抑制Bax和caspase-3的表达来抑制高糖高脂诱导的NIT21细胞凋亡[10]。黄连素可通过增强缺氧/ 复氧损伤中的心肌细胞的Bcl-2 蛋白的表达来抑制由缺氧/ 复氧所造成的心肌细胞的凋亡[11]。

  1.5 影响信号通路在很多恶性肿瘤中均发现Cyclin D1过度表达,Cyclin D1已经被确认为一个癌基因。在正常人体组织中,Cyclin D1蛋白呈低水平表达,当Cyclin D1表达失控时,将引起细胞增殖周期失调,导致恶性肿瘤发生。小檗碱能抑制Cyclin D1表达,对Cyclin D1相关信号通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用,对异常激活的AP-1信号通路活性仍有显著的抑制作用,能降低细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun含量,并抑制Cyclin D1基因启动子区与AP-1转录因子的结合,从而抑制Cyclin D1基因的转录水平,降低Cyclin D1的表达[6]。

  尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(u-PA)和基质金属蛋白酶(MMPs)在癌症转移和血管发生中起很重要作用。抑制u-PA和MMPs后能够抑制癌症细胞的迁移和浸润。 Yung Tsuan Ho[12]发现小檗碱能够影响p-JNK, p-ERK, p-p38, IkappaK 和 NF-kappaB介导的信号通路来抑制人舌头鳞状癌细胞SCC-4中的MMP-2和MMP-9的作用;小檗碱还能够通过对FAK, IKK和NF-kappaB介导的信号通路的作用降低SCC-4中u-PA,MMP-2和-9的表达,从而抑制SCC-4的迁移和浸润。

  1.6 免疫调节黄连提取物能抑制地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡,对小鼠胸腺细胞具有一定的保护作用,可在一定程度上使其免受外源性糖皮质激素的损害,有提高免疫机能的作用。

  大量研究结果表明,中药能诱生和增强机体的免疫功能,通过增强机体免疫功能,诱生细胞因子如白介素-2(IL-2), 干扰素(IFN)等,诱导淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAKC)产生及自然杀伤细胞(NK)增殖,从而介导肿瘤细胞发生凋亡。北美黄连总提取物处理乳腺癌MCF-7雌激素受体阳性细胞后, IFN-β和TNF-α特别是IFN-β的mRNA表达量显著提高。利用中和抗体抑制IFN-β增加,则明显抑制黄连诱导的抗增殖效应,表明黄连的作用与IFN-β有关,同时说明该阶段存在活化IFN-β的自分泌途径[13]。

  2 抗肿瘤体内研究

  药物药理疗效从体外转入体内研究对于能否继续用于临床药理研究将是一个关键。Ho YT等[14]利用小檗碱能够体外诱导人舌头鳞状癌细胞凋亡,进一步作用于体内异种嫁接该瘤鼠类动物模型,其也能够明显抑制肿瘤的生长,表明小檗碱在临床上能够用来治疗和预防舌头瘤。小檗碱的体外作用活性已经得到公认,体外研究扩展到体内研究并应用于临床抗肿瘤治疗将有巨大的现实意义。

  3 抗糖尿病作用机制

  黄连根茎具有降低血糖的特性,长期以来,在传统中医处方中,用来治疗糖尿病。已有动物实验和临床研究表明作为异喹啉类生物碱小檗碱能够改善高血糖症和改进胰岛素耐受性[15~17]。

  3.1 降糖并保护糖尿病大鼠周围神经黄连生物碱特别是小檗碱通过降低糖尿病大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白比值和血清甘油三酯和胆固醇水平,提高糖尿病大鼠血浆胰岛素水平。提高坐骨神经感觉和运动传导速度,缩短动作电位潜伏期,调节自由基代谢紊乱,减轻脂质过氧化反应抑制多元醇代谢通路中活性和改善血液高粘状态增加坐骨神经营养因子的表达而改善糖尿病大鼠周围神经功能和结构,保护糖尿病周围神经的病变[18]。

  Jiyin Zhou[19]发现小檗碱能够减少糖尿病小鼠的体重,肝重以及降低肝脏重量与体重的比例,能够恢复糖尿病小鼠血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B等的量的增加;同时,高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白AI等比正常水平的量减少。且能够增加肝脏中PPARα/δ的表达和减少PPARγ的表达,改善糖尿病小鼠血液和肝脏糖脂代谢。

  3.2 改善糖尿病性肾病变糖尿病性肾病变是一种糖尿病微血管并发症,将导致终末期肾脏疾病。小檗碱能通过控制血糖,减少氧化应激和抑制多元醇活化途径来改善糖尿病性肾病变小鼠的肾功能不全[20]。Weihua Liu认为小檗碱能通过P38MARK信号通路途径抑制高糖处理过的肾小球细胞纤维蛋白和胶质原的结合作用,抑制P38MARK磷酸化或通过抗氧化作用影响信号通路,从而改善糖尿病性肾病变[21]。

  3.3 防止内皮损伤和增强血管舒张 内皮损伤是导致肥胖、糖尿病、高血压病、心血管等疾病病发的关键因素。小檗碱以浓度依赖性增强离体培养小鼠内皮血管细胞一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化,促进eNOS与热休克蛋白90的联合而增加一氧化氮的产生,且小檗碱还能减弱高糖诱导的活性氧的增加、细胞凋亡、核因子κ-B活性、粘连分子的表达等,从而抑制单核细胞对内皮的黏附。另外,在小鼠主动脉环,小檗碱引出内皮组织依赖的血管舒张和减轻高糖介导的内皮机能异常,通过AMPK信号级联的激活作用介导防止内皮损伤和增强内皮组织依赖的血管舒张[22]。

  3.4 减少细胞因子对胰岛细胞的损伤效应Eun kyung Kim[23]研究表明,黄连提取物能够抑制S-亚硝酸-N-乙酰青霉胺 诱导的细胞凋亡,预测黄连提取物的防御作用能够对抗细胞因子诱导的胰岛β-细胞坏死。利用黄连提取物处理体外培养胰岛β-细胞,可明显抑制白细胞介素-1β和γ干扰素诱导产生一氧化氮,其抑制iNOS基因表达的分子机制涉及抑制NF-κB的激活作用。与未受药物刺激的细胞相比,细胞核中白细胞介素-1β和γ干扰素刺激RIN细胞使NF-κB结合活性增加以及p65亚基水平的增加,细胞质中的Iκ-B降解,可知其防御效应减少了NO产生和iNOS表达,从而减少细胞因子对胰岛β细胞的损伤效应。

  3.5 调控信号转导通路小檗碱能促进3T3-L1细脂肪细胞分化和降低脂质积聚,其作用与通过促进3T3-L1中PPARα,PPARδ,PPARγ,CDK9,cyclin T1表达相关。RNAi下沉默CDK9基因,3T3-L1中PPARα,PPARδ,PPARγ,CDK9,cyclin T1表达受到抑制,小檗碱具有翻转干扰效应并促进表达的作用,还可部分地通过影响CDK9参与脂肪细胞的分化功能,进而影响PPARs活性,使组织中糖脂代谢活动及相关酶、脂肪因子等恢复至接近常态,最终使2型糖尿病大鼠的糖脂代谢紊乱症状得以改善。因此,小檗碱的降糖调脂作用与其通过调控PPARs/P-TEFb信号转导通路相关[24]。