多重PCR检测急性非淋巴细胞白血病IgH及TCRVγΙ-Jγ

  免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)基因重排发生于造血干细胞向淋巴系分化早期,其独特的V-D-J重排可作为B淋巴系和T淋巴系克隆的特异性基因标志,已被国内外较广泛应用于淋巴系肿瘤的分型、微小残留病的检测及基因分型等研究。为进一步了解急性非淋巴细胞(ANLL)是否也存在上述两种基因重排,采用多重PCR技术检测41例ANLL病人IgH及TCRVγI-Jγ基因重排。

  1材料与方法

  1.1病例经形态学、组织化学和免疫学确诊的41例ANLL患者,年龄20~63岁,24例,17例。41例中ANLL FAB分型M11例,M212例,M3 7例,M4 8例,M5 10例,M6 2例,M7 1例。37例为初发病人,4例为缓解病人。

  1.2寡核苷酸引物选择 利用计算机辅助设计分别对IgH、TCRγ链V区和J区共同保守序列的引物,遵循PCR引物设计的原则,保证每条引物及4条引物间无互补结构,引物间Tm值相近,两者扩增后分别在400和110 bp出现阳性扩增带,电泳后较易鉴别。引物序列如下:VH:5′-ACACGGCCGTGTATATCTGT-3′;JH:5′-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3′;VγI:5′-TCTTCCAACTTGGAAGGGAGA-3′;Jγ:5′-CCCTCTATTACCTTGGAAATG-3′。所有引物均由上海细胞生物所合成。

  1.3DNA样本的提取用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,参照文献[1]应用0.45%NP40-蛋白酶K法提取DNA。

  1.4多重PCR扩增多重PCR扩增IgH和TCRVγI-Jγ重排,引物方面采用计算机辅助引物设计,通过不断改变Mg离子浓度和退火温度,优化循环参数及条件而建立。20 μl反应体积加入2 mmol/L dNTP 2 μl,10×PCRBuffer2 μl,25 mmol/L MgCl2 1.5μl,IgH及TCRγ链引物各10pmol,95℃预变性后加入Taq酶1.5U,循环条件为94℃变性1 min,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,5个循环后改为94℃变性40 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s共25个循环,最后72℃延伸10 min。取6μlPCR产物在2.5%琼脂糖凝胶,1×TBE液中电泳,溴化乙锭染色10 min,紫外灯下观察结果。为避免实验结果存在假阴性和假阳性,所有被检标本于检测同时均设置阳性对照和双阴性对照(含正常人DNA阴性对照和只缺模板核酸的试剂阴性对照),并在检测过程中,严格遵守PCR操作规则,确保检测结果的可靠性。

  2结果

  2.1ANLL患者基因重排的检测结果IgH基因重排阳性的病例经PCR扩增后在110 bp上下可发现特异性重排带,TCRVγI-Jγ基因重排阳例在400 bp上下可出现特异性重排带,IgH及TCRVγI-Jγ基因重排均阳性的病例则在110和400 bp上下各可发现一条特异性重排带。41例ANLL患者经多重PCR扩增后3例发现单一IgH基因重排,5例发现单一TCRVγI-Jγ基因重排,3例(7.3%)则同时存在两种基因重排(图1)。IgH基因重排阳性率为14.6%(6/41),TCRVγI-Jγ基因重排阳性率为19.6%(8/41),IgH或TCR基因重排总阳性率为26.8%(11/41)。ANLL病人中IgH基因重排和TCRVγI-Jγ基因重排阳性率无显著差异(P>0.05)。11例IgH或TCRVγI-Jγ基因重排阳性病例中9例为初治病例,2例为缓解期病人。

  2.2基因重排阳性病人的临床预后我们追踪37例初治的ANLL病人经常规DA(柔红霉素联合阿糖胞苷)或HA(三尖杉酯硷联合阿糖胞苷)方案治疗后转归情况,结果显示9例基因重排阳性初治ANLL病人仅3例(33.3%)获完全缓解(CR),而28例基因重排阴性ANLL病人经上述方案治疗后CR率为75.0%(21/28)。基因重排阳性ANLL治疗CR率低于重排阴性ANLL(P<0.05)。2例缓解期检测基因重排阳性病人分别于检测阳性后3个月和9个月出现形态学复发,而2例基因重排阴性的缓解期病人,1例CR 15个月后复发,而另一例为M3患者,经自体骨髓移植术后已持续缓解53个月。

  2.3微小残留病的检测在41例ANLL病人标本中,有2例是处于CR期的病人,亦检测出基因重排阳性。对此2例病人追踪观察发现,其在检测阳性3个月和9个月后发现临床和骨髓相复发。另2例初治具有基因重排阳性ANLL病人,虽经DA方案治疗后获CR,但在缓解期中,此2例病人标本经PCR扩增后仍持续发现基因重排阳性。此2例病人分别于缓解后5个月和6个月出现形态学和临床复发。从而提示重排基因的检测在ANLL的微小残留病研究中也有一定意义。

  3讨论

  以往认为IgH基因重排仅发生于B淋巴细胞系肿瘤,TCR基因重排则为T淋巴系肿瘤的特异性基因标志。但近年来研究表明,IgH和TCR基因重排也可发生在其他分化序列的细胞上,如T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)可出现IgH基因重排,B-ALL也可发生TCR基因重排,这一现象又称序列失真(Lineageinfidelity)现象,目前认为该现象产生是由于Ig和TCR基因既具有同源性,又有相同的重组酶,在早期淋巴细胞分化中,可能缺乏严格界线,当细胞分化时,Ig与TCR重组酶处于活化阶段,当发生重排的调节机制异常时,同一的重排酶可将两个基因错误进行重排[2,3]。本研究结果显示3例ANLL病人同时存在IgH和TCRVγI-Jγ基因重排现象可能也与调节机制异常导致同一重排酶错误将两个基因同时进行重排有关。

  随着分子生物学技术进展,白血病的分型研究由单纯形态学发展至MIC(形态学、免疫学和遗传学)及基因分型水平。国外有文献报道应用Southern杂交技术可发现部分ANLL病人存在IgH或TCR基因重排。我们应用多重PCR技术检测41例ANLL患者IgH及TCRVγI-Jγ基因重排,结果显示26.8%ANLL病人存在IgH或/和TCRVγI-Jγ基因重排,进一步证实IgH和TCR基因重排不仅发生于淋巴系肿瘤,也可发生部分ANLL病人,故检测IgH或TCR基因重排进行分型时,单纯IgH或TCR基因重排阳性并不能确定为淋巴系,而须结合形态、组化和免疫学等检查综合分析。关于部分ANLL病人也发生IgH或TCR基因重排的机制,目前认为,这部分病人的白血病起源于较早期多潜能干细胞或淋髓前体细胞水平,它可同时表达几种序列的标志,随着细胞的定向分化,这种重排仍然存在[3];此外,在部分ANLL病人中,除髓系白血病主克隆外,可能还存在着淋巴系的寡克隆[4]。临床上存在的系列转变现象,如起病时为ANLL经治疗缓解后复发却表现为ALL,也从一侧面支持这一观点,此机制尚需进一步研究。

  我们结果还显示具有TCRVγI-Jγ基因重排ANLL临床治疗缓解率低于重排阴性ANLL,其机理尚不明确,可能与这类病人白血病克隆起源于较早期干细胞或前体细胞水平有关,也可能与基因重排阳性ANLL病人例数少及随机性有关,尚待扩大病例数进行观察。1例缓解期及2例治疗后缓解期病人可检测出TCRVγI-Jγ基因重排,且此3例病人均于半年内出现临床和形态学复发,说明应用PCR技术检测髓系白血病TCRVγI-Jγ重排基因也可应用于微小残留病的监测和早期预测复发的研究。

  应用多重PCR技术可以一次PCR循环同时扩增IgH和TCR基因重排,对基因重排的检出率高于单独检测单个基因重排;而与分别扩增的方法比较,多重PCR技术可减少加样次数,降低污染;减少Taq酶、dNTP和DNA标本用量,降低费用;简化操作步骤,提高工作效率等优点,更适合临床检测需要。