第四节 样品的前处理

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样品的正确收集与处理,是蛋白质及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的样品与测定项目,其前处理有不同的要求。下面以神经肽测定为例,介绍样品的前处理方法。

一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取(以大鼠为例)

1.大鼠称重后,在尽量安静的情况下,迅速断头、取躯干血。

2.尽快取下全脑、脊髓(某段)与垂体,在沸生理盐水中煮5min,以灭活酶,保持神经肽的稳定。

3.

4.脑区等称重。

5.把脑区、垂体或脊髓,分别置于玻璃匀浆管内,加入1mol/l HAC(或HCl)1ml,充分匀浆后倒入塑料指形管中,在室温下放置100min,使生物活性物质充分溶解在酸中。

6.加入1mol/l NaOH 1 ml,中和酸。

7.离心,取上清。

8.低温(-20以下)保存待测。

二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法(以下丘脑为例)

1.大鼠迅速断头,取出全脑,置沸生理盐水中煮5min。

2.将全脑置于取材角度器上,分别于视交叉前和乳头体后用双面刀片垂直切断,取下丘脑块。

3.将双面刀片装在切片机上。

4.将下丘脑置于切片机机载物台上,腹侧向下,并用502胶水固定。在脑块后方适当放置琼脂块以利固定。

5.开动振动切片机,缓慢移动推进器,切片厚400~500μm。用毛笔沾生理盐水,小心收集切片置于平皿内的生理盐水中。

6.将脑切片平置于橡皮板上,并在体视显微镜下,参照鼠脑立体定位图谱,确定神经核团位置。

7.选择相应直径的穿孔器,分别于两侧核团上垂直插下,然后推出针蕊将所取核团组织放入匀浆器中。

8.加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分匀浆后倒入放免测定管中,放置100min。

9.加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸,离心(3000rpm/min)20min,取上清液,低温保存待测。

三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取(以胃粘膜为例)

(1)取下胃粘膜后,迅速称重置于试管,中沸蒸馏水1ml,在水浴中煮100min。标本在室温下放置,其中的生物活性物质会被酶降解,所以要立即加热处理。

(2)冷却后倒入特殊的匀浆器中,充分匀浆(使用电动搅拌器)。匀浆液倒入塑料指形管中,再用蒸馏水1ml,冲洗匀浆器,并倒入上述管中。

(3)离心,取上清,低温保存待测。

四、血浆

1.直接测定

(1)加酶抑制剂:准确采全血若干毫升,注入预冷的加有①抗凝剂0.3mol/l EDTA·2Na(乙二胺四乙酸二钠)溶液(每毫升全血20μl)、或1%肝素(每毫升全血10μl);②抑肽酶(每毫升全血500单位)的塑料指形管中,迅速低温离心,取血浆低温保存待测。

抑肽酶有液体的(标签写的有每毫升含多少单位)与固体的(每毫升含12TIU,1TIU=900KIU,即每毫克含10800单位)。固体的抑肽酶可用生理盐水溶解,使之每20μl含500单位。

(2)酸化处理:每毫升血浆加1mol/l HCl 0.2ml,低温保存待测。测定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

以上两种方法,任选一种即可。

2.间接测定 血标本经提取后,可去除蛋白质等干扰因素,并使微量的生物活性肽浓缩,但较费时,成本也高。常用的提取方法有:

(1)柱层析提取法:有多种层析柱可供提取不同的神经肽,其中较为方便的是用Sep-pak C18层析柱提取。主要步骤步:

①柱的预处理:该柱有两头,长头连接注射器,可注入溶液与样品,短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml,使柱中的生物胶活化。

②注入样品(如血浆、脑脊液腹水、尿等):样品中的水份流出,生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前,如先去除蛋白,可增加柱子的使用时间。]

③淋洗:用4%HAC溶液100ml注入柱中,以洗去一些杂质。

④洗脱:用7ml酸性乙腈(按容积算,每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸馏水21ml)作为洗脱剂,注入柱中,把生物活性肽洗脱下来,收集在塑料指形管中。

⑤清洗:用乙腈、蒸馏水清洗柱子,以备后用。

⑥将洗脱液吹干,低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。

Sep-Pak C18柱层析,也可用于制备标记抗原时的层析纯化。

(2)加膜藻土提取法:

①抽血:用一次性塑料注射器抽取受试者静脉血4ml,置于加有肝素(125单位/ml 全血)指形管中。

②分离血浆:在4下离心,取出血浆。

③血浆酸化:取2ml血浆,加入1mol/l HCl 0.5ml, 摇匀。

④吸附:加入0.5%藻土悬液2ml,在水平震荡器上震30min。离心,去上清,留沉淀。

0.5%藻土县液(Fuller’s earth)的配制:

0.5gFuller’s earth

0.1gDextran T70

100ml去离子水

⑤洗脱:在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml,在漩涡振荡器上振2min,离心,取上清置于经硅化的玻管中。

80%酸性丙酮的配制:

80ml丙酮

20ml1mol/L HCl

⑥去脂:加入石油醚1ml,摇匀,脂肪溶解在石油醚中,分层后吸去上层。

⑦干燥:下层液体,置于37℃水浴中,用氮气(或空气)吹干。

⑧低温保存待测。测定时用一定量缓冲液溶解。

(3)有机溶剂提取法:常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。将溶剂按一定比例,加入标本内,混匀、振荡、离心,取上清吹干,冷藏待测。通常在有机溶剂中加入适量的酸。

在这些方法中,以柱层析法最稳定、准确,但成本高,推广不易。加膜藻土法,提取率较高,但操作复杂、费时。有机溶剂提取法操作方便,成本也低,虽稳定性较差。

五、脑脊液

1.煮沸收集脑脊液时,管子浸在冰水中。收集完毕,立即在沸的水浴中煮5min。离心、取上清;低温保存,待测。

2.酸化在1ml脑脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml;测定时,再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

3.加酶抑制剂

4.柱层析提取

以上方法,任选一种。

六、尿

尿液收集于事先加有适量醋酸或盐酸的容器中,使pH达4左右,煮沸1~2min,冷却后离心,取上清,加适量NaOH液,使尿液pH达7.0左右。此尿即可用于直接测定或经提取后再测定。

尿认提取法相同。采用Sep—Pak C18柱层析提取较为方便,因尿中不含蛋白,柱子可多次使用。

七、胃液

抽取胃液,注入加有抑肽酶的管中,离心,取上清,低温保存待测。

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