第二节 免疫铁蛋白技术

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一、基本原理

铁蛋白是一种含铁约占23%的蛋白质,分子量460kD,直径10~12μm。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物既保留抗体的免疫活性,同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心,铁胶粒直径核心为55~60nm含2000~3000个铁原子,分布于四个区域,形成四个圆形致密区,具有很高的电子密度,便于电镜观察。铁蛋白来自许多动物,以肝、脾含量较高,其中马脾脏含量最高。因而,商品铁蛋白主要是从马脾脏中提取的。

二、铁蛋白的提取和纯化

取健康的马脾(新鲜或冰冻均可),去除脾外的淋巴结和脂肪组织,按湿重1:1.5或1:2加入蒸馏水,用组织匀浆器将组织匀浆,置水浴中加热至75~85℃,使铁蛋白以外的蛋白质变性,冷却后用2~4层纱布过滤,滤液离心取上清液,每100ml上清液中加入35g硫酸铵,充分搅拌使铁蛋白沉淀析出,4℃过夜,3000~10000r/min离心20min,弃去上清液,刮取沉淀物置透析袋内,剩余沉淀物以蒸馏水洗后,一并加入透析袋内对水透析,除去硫酸铵。100ml中加入4~5g硫酸镉使炎结晶,在室温或4℃冰箱内使之出现铁蛋白结晶。此铁蛋白结晶以2%硫酸铵(pH5.58)溶解后,如上述再用硫酸镉使之结晶。反复溶解,结晶六次,达到纯化。纯化后铁蛋白在半饱和的硫酸溶液内可保存1~2年。用时以蒸馏水透析除盐后即可应用,应用前可以用负染色法在电镜下观察,了解铁蛋白的完整性和纯度。

商品制备的铁蛋白是用2%硫酸铵溶液稀释的1%~2%溶液(pH5.85)。为了在应用中得到满意的结果,应用前必须将商品制备的铁蛋白进一步纯化。纯化的方法是用0.1n NaOH或0.1n HCl调整pH值至5.85,然后加入20%硫酸镉溶液使其在铁蛋白液中最终浓度为5%硫酸镉,此溶液置于4℃冰箱内2h(或过夜)至结晶完成,离心1h(2000r/min)充上清液。铁蛋白结晶再溶解,离心除去不溶性颗粒,倾出上清液,加入5%硫酸镉再结晶,至在显微镜下呈棕红色铁蛋白结晶为止。将结晶溶于2%硫酸铵溶液中,用50%5硫酸铵溶液沉淀三次,第三次沉淀形成的沉淀物溶于少量蒸馏水中,先对自来水透析,再对0.05mol/L,pH7.5磷酸缓冲透析12~24h。纯化的铁蛋白溶液用100000r/min 超速离心2h ,除去3/4无色上清液,沉淀物(内含铁蛋白)在4℃过夜,待完全融解后,用微孔滤过器(Millipore filter, 孔径 0.25~0.45μm)过滤,保存1~2年内仍可使用。

三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合

一般用低分子量的双功能试剂把两者联结起来,常用的双功能试剂有间苯二甲基二异氰酸盐(简写XC)。甲苯2,4二异氰酸盐(简写TC)。邻茴香胺(简写BDD);对,二氟一间,间,二硝基二苯矾(简写FNPS)和戊二醛。近年来,普遍认为戊二醛作为联结剂效果较好,对抗体活性影响小,标记抗体产量高。分为一步法和二步法,现简介如下:

1.一步法 以15mg 铁蛋白和3mg球蛋白溶于0.9ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中,pH7.0,加入0.1ml新鲜配制的戊二醛溶液,使其最终浓度为 0.005%~0.05%, 加入0.02%叠氮钠(NaN3)防腐,此混合液置37℃24h,无需搅拌,结合完毕后加0.01mol/L赖氨酸中止反应。

2.二步法

(1)在含50~80mg铁蛋白的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中,加入稀释的戊二醛,使其最终浓度为0.05%~0.15%,总体积为1ml。

(2)置37℃作用2h后,经葡聚糖G—25 滤柱,除去未结合的戊二醛。为避免不必要的稀释,只收集脱峰的中间部分。然后加入球蛋白(铁蛋白与球蛋白之比为5:1)即铁蛋白最终浓度为15mg/ml,球蛋白3mg/ml。

(3)混合液置37℃,作用12h(无需搅拌),加入0.01mol/L 的赖氨酸以中止进一步交联。两步反应都需在0.02% NaN2防腐条件下进行。

四、电镜标本的制备方法

1.固定  同常规电镜一样,应用醛类和四氧化锇双固定,以维持细胞和组织的超威结构。有文献报告以4%的甲醛溶液在pH7.2的磷酸缓冲内,在0℃进行固定,并用四氧化锇作后固定,不会影响抗原的反应能力。高锰酸钾能使大部分抗原失去活性,一般不宜采用。另外,铁蛋白标记抗体的特点之一是分子量大。因此,如用于细胞表面抗原的定位研究,可将样品直接放入固定液,否则需采取适当的措施,打破细胞膜,增强细胞对标记抗体的通透性,常采取以下方法:

(1)冻融法:将小块组织或细胞经固定后,冻融一次,使细胞膜破裂,标记抗体能进入细胞内。

(2)冰冻切片法:固定后组织快速冷冻,切成10~15μm左右薄片,溶化的切片直接浸泡于铁蛋白标记抗体液中。

(3)有报道经戊干杯固定后,浸入4×10-3mol/L洋地黄皂甙液中1~2min,能有助于增强细胞膜的穿透性,使标记抗体液进入细胞内。

2.免疫反应处理  常用包埋前染色,分直接法和间接法两种。在染色前,将组织切成约10~20μm厚的薄片。

(1)直接法:将薄片直接浸泡于标记抗体液中,室温或37℃作用1~2h或更长;缓冲液(有人提倡用冷缓冲液)浸漂,除去未结合的标记抗体溶液,然后转入常规双固定和电镜包埋。

(2)间接法:

①将组织切片浸于第一抗体液中,室温30~60min。

②以大量冷缓冲液充分搅拌洗涤,至少3次,每次30min。

③浸入铁蛋白标记抗体液中,室温30min。

④如②,用缓冲液充分洗涤后,可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片。

⑤将离心沉淀小块,用四氧化锇固定30min。

⑥常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。

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