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《实验动物科学》 > 第十章 生物医学重点研究课题中的实验动物选择与应用

第八节 微循环研究中实验动物的选择和应用

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一、微循环研究中动物和实验方法的选择

(一)动物选择

远在300年前就有人观察了冷血动物的微循环,如青蛙的舌、蹼、肺和肠系膜;金鱼的尾巴;蝌蚪的尾巴;蜜蜂的眼睛……等等。在1831年Hall和1850年Paget等详细地描述了蝙蝠翅膀的微循环,但是这些动物都离人的抗体结构和生理功能太远。蝙蝠虽然是所谓的哺乳动物,但其生活习性却与一般哺乳动物大不相同,其机体反应性也因其感觉器官之独特而区别于人,美国有的实验室(Nicoll,1946;Mohos,1961;Wiedeman,1972)用蝙蝠观察微循环时,事先需将蝙蝠养于温度为5~10℃并且湿度极大的冰箱中。又因蝙蝠是夜醒动物,其神经系统白天处于抑制状态,所以不适于进行微循环各项生理参数的测定。更不宜于选它为靶子进行微循环对各种药物应答反应的研究。

国际、国内通常用以进行微循环研究的动物有:小白鼠、大白鼠、金黄地鼠、家兔、猫、狗,最近也有用羊、小牛或猴子的。

(二)研究微循环方法的选择

研究微循环的方法很多,有间接法(如86Rb测心肌营养性血流量)和显微直接观察法之分。后者一般又分两大类:一类是体表微循环实验方法,另一类是内脏微循环实验方法。体表微循环动物实验方法有金黄地鼠颊囊循环,家兔眼球结膜和眼睑微循环,家兔舌尖微循环,蝌蚪尾部微循环,还有兔耳、兔耳透明窗和大白鼠气管微循环等。

内脏微循环的实验研究方法也很多,有用动物的肠系膜、心肌和肝脏等来观察研究其微循环,其中观察肠系膜的方法种类较多,可用大白鼠、家兔、豚鼠、小白鼠等的肠系膜。也有利用脏器“开窗”手术作慢性实验,例如动物行头颅和腹腔开窗术,观察脑和腹腔有关内脏的微循环。还有取用观察部位的活组织电子显微镜观察并作超微结构摄影。

当前物理化学的研究方法--血液流变学也不断被采用,例如红细胞电泳、血粘度的测定,测定微血管的压力,血小板和红细胞凝集功能的测定,血小板粘附性的测定等方面的研究以及观察毛细血管通透性的变化等。

近代先进技术的不断发展,无疑地也推动着微循环实验方法的不断更新和发展,运用放射性同位素86Rb测定小鼠心肌营养性血流量,因心肌摄取86Rb的能力和心肌毛细血流量成正比。

近年来国外使用电视一电子系统、激光显微系统、快速摄影、微循环电影和磁带录像等新技术研究微循环,这必将使微循环方法的科学性和客观性大大地提高。

二、进行微循环动物实验的几个原则

(一)动物的麻醉

远在1944年曾有人在微循环的研究中发现:给小动物进行戊巴

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有些实验动物不需麻醉,可在动物清醒状态下进行,如兔眼球结膜微循环的检查方法等。

(二)恒温灌流

原则上,动物器官或组织的灌流液应是与该器官或组织周围体液环境的成份和pH完全一样,例如对肠系膜来说应有腹腔内液的环境,但是很难做到的。

Zweifach认为:无论应用什么灌流液,首先应使它成为胶体状态,即在灌流液中加入明胶,使之成为1%的明胶溶液。

灌流液中应该通过适量的氧和二氧化碳。灌流液的pH应以缓冲液调至中性(pH为7.35)灌流液的温度应以控制器控制在动物正常体温范围。灌流液在整个实验过程中应不停地慢速更换。常用的灌流液有林格氏液、台氏液、凯氏液、生理盐水等。灌流装置和所观察的动物应放在装有可调节的恒温实验观察箱中进行,此点在冬季显得尤为重要。将实验观察箱中的温度调节到与实验动物体表温度相近的温度,最好在25~30℃。

(三)照明装置

照明装置的温度一般不能超过动物体温。最好保持在25~30℃,否则会引起血管扩张及微血流异常。照射灯光最好不改变血液自然的色调,否则不易辨别血氧饱和程度。最理想的照明装置是纤维光束冷光源,尤其在进行肝、脾、肾等脏器的微循环观察时,没有可以伸进腹腔去的冷光源照明棒是很难进行实验的。

实验时用的照明光源,应该具备三个条件,即强、聚、“冷”。目前常用的有两种照明装置,一种是高压水银灯(220V,80W),此光源的优点是光线强,产热较少,血管与底色间反差强,缺点是血色不真实,光源触发启动慢。另一种是钨卤素灯(5~12V,40~100W),后者具有体积小巧,光线白亮,启动快的优点。钨卤素灯可用显微镜灯加以改装,因其有透镜,能调节焦距,又能达到“聚光”的目的,再在此灯前加上蓝绿色的隔热滤光片,即可控制光源温度,达到相对“冷光”的要求。此种照明光源能在普通室内保证显微镜下视野清晰,而且对观察指标影响较小。

(四)记录系统

动物微循环的瞬间变化常采用显微摄影装置来记录。选择好显微照相装置及相应的洗相设备。为了保证摄影的成功,凡是活体摄影,均需要使用拆射光源,要使用快片(24定以上的微粒胶卷)摄影,这是一个关键问题,还要增强反差(用绿色滤光片增强血管与底色间的的反差)。

照相机是一般的记录工具,它只能留下瞬间的图象,有条件最好能拍摄电影或进行彩色磁带录像。

对于管径扫描的曲线、血流流态曲线或微压力曲线要用示波器或多导记录器进行记录,如能用微处理机记录并贮存上述信号则更理想。

三、观察动物微循环障碍时的主要指标

(一)管径

用目镜测微器测量微细动脉与静脉的管径大小。如有摄影设备,在每次观测中摄片,然后用量规在照片上量取管径;或将微血管放大若干倍投影于示教屏上,再用量规在示教屏上量取管径。示教屏上的长度则事先通过物镜测微顺标定好。

微血管的管径还可采用较先进的仪器来测量,如可用微电脑控制的多功能显微图像测量分析仪来测量。该分析仪能对实验时微观结构进行一维(线径、周长)及二维(面积、环)的参数测量,测量精度分别为±1%、±1.5%,从而可对微观察结构变化前后作定量分析比较。并且可对运动目标自动测速,精度±2%。对被测量对象的线径动态变化进行测量和记录,对微粒进行计数。现我国上海已有生产。

(二)流速

目前测定血流速度的方法有两种。一种是秒表法--用目镜测微器和秒表测定,计算血细胞流径口径2~3个红细胞的微血管1mm距离所需的时间,重复测定三次,取其平均值。若作动态比较时应选择固定血管进行观察,此法仅在流速较慢时应用。另一种是示波器光点扫描同步法。该方法的基本原理是将示波器上扫描的光点与镜下见到的流动的红细胞,使之在皮层视觉感受区内重叠,以致造成光点与红细胞在同一视野中流动画面,调节示波器上的粗调和微调,使之示波器光点扫描速度与红细胞流速同步,这时示波器上的读数即可代表红细胞的流速。有条件时可采用上述图象分析仪测量。

(三)流态

描述血细胞流动时的形态。正常时在口径为1个红细胞的微血管中,血细胞流态呈直线状。当静脉注射高分子右旋糖酐引起微循环障碍后,血液流态和血液流速均有异常改变。血流状态由正常的直线状变为断线状或虚线状。在口径为2~3个红细胞的微血管中,正常时,流态可呈带状,给予高分子右旋糖酐后,变为粒状、絮状,甚至出现流动的微小血栓。此时血液速显著减慢,甚至有的血管区内出现来回摆动和暂停现象。

(四)毛细胞管网交点计数

计数的方法是:取面积约为1mm2左右的四周由血管围或边界的固定血管区域,计算此血管区域中的毛细血管与边界血管的交点数,未与边界相交的毛细血管不计算在内。

(五)血色

血色分鲜红、暗红和淡红等。正常血色为鲜红色。观察造成微循环障碍和给药后血色的变化情况。

四、可进行微循环观察的动物器官及方法

(一)头部器官

动物的眼球结膜、虹膜、眼底、鼻粘膜、口唇、牙龈、舌、鼓膜、耳壳等都可以普通显微镜在放大40倍到100倍的条件下进行微循环观察。这些部位的动物观察方法与人的相似。以家兔眼球结膜观察方法为例:要选用白色家兔,因其球结膜色白,微血管精晰可见。不可采用灰色或黑色的家兔,因其球结膜色深,不易辨别其微血管。将2~2.5kg体重的白毛家兔的在清醒状态下侧卧位置于一特制的长方形固定盒内,使两耳及其头部露出,头颈部和嘴用兔头夹和铁环加以固定,剪去左侧眼睑睫毛,以眼科开睑器将上下眼睑撑开,暴露出球结膜血管,然后用高压水银聚光灯,以45度斜照于球结膜上,双目解剖显微镜放大40倍,可直接观察到球结膜的微循环。

(二)气管微循环观察法

选用大白鼠或家兔麻醉后,剪去下颌及颈部的毛,消毒皮肤,固定四肢(仰卧)。沿颈正中线自下颌部甚胸骨上缘作垂直切口,剥离软组织与肌肉,小心不要损伤血管,用两把纹式止血钳夹住两胸锁乳突肌中部轻轻拉开。于甲状软骨环上轻轻剪断一对胸骨甲状肌及其附着的肌膜,将该肌肉放于远端,便可暴露自甲状软骨至第十软骨环间区的气管,轻轻于解剖镜下(放大16倍)剔去气管表面的结缔组织,便可以将光射于放大60倍左右的气管软骨上以及软骨环间区的粘膜上观察微循环的动态变化。观察应于恒温装置中进行,并在气管表面滴以恒温灌流液。

正常大鼠或家兔气管软骨环间区的微血管较为丰富。细静脉、细动脉血流方向相反,毛细血管网穿插于细动脉和细静脉间,而在软骨环表面上有极细的毛细管网。微血管内血流均匀,流速较快,血管充盈度良好。连续观察25~30分钟不见有明显改变。气管炎模型的大鼠气管微循环出现明显变化,变化程度与气管粘膜病变程度密相关。活血化瘀药物注入后,可明显改善大鼠气管炎微循环障碍。

(三)肺微循环观察方法

一般用家兔、猫、狗或其它大动物进行。动物麻醉后呈右侧卧位固定于动物台上,净皮、去左胸部的毛,消毒皮肤。于第三、四肋间作弧形切口,剥离皮肤,沿胸骨边缘轻轻剪断胸大肌、胸小肌的附着处,将二肌肉剥向一边。在三、四肋间沿肋骨边缘用钝头眼科剪和眼科镊轻轻剔去肋间肌。注意要特别小心,谨防损伤胸膜。只要在胸膜上造成针尖大小的孔,肺便可发生萎陷。因此,肋间肌要一束一束仔细地剔去。最后可暴露无遗1cm见方的窗,透过透明的胸膜于显微镜下观察肺循环动态。此即“胸膜开窗”法。

开窗部位最好在第三、四肋间或第五、六肋间靠中线的地方。此外较薄的肺叶以心包作衬底,易于观察。由于观察的是呼吸着的肺,所以观察者要善于抓住动物的呼吸规律,选其呼吸空间进行观察,也可进行照明。

“胸膜开窗”是观察活体肺微循环的唯一可行的办法,因为肺脏一暴露于空气下便萎缩。如能将染料注入法、同位素注入或荧光示踪及肺血流量测定法与胸膜开窗活体观察法配合进行,便可得到更理想的结果。“胸膜开窗”观察肺微循环是可以连续进行的;第一次观察完毕后,可用一圆形有机玻璃薄片敷于窗上,以缝线固定于周围肌肉,将胸小肌、胸大肌恢复原位,缝合皮肤切口,加强护理。可于第2天、第3天、第4天连续重复上述步骤,进行反复观察。一般在第4、5天,胸膜上便生出一层结缔组织,变为不透明。此时如有必要可选其它肋间进行再次开窗,手术应在消毒条件下进行。

(四)背斜方肌微循环观察法

大鼠背斜方肌很薄,表浅,易于照明,面积宽而长,血管神经可保持完整。制备方便而简单,10~15分钟可完成全部制备。此外皮肤切口可丝毫不损伤周围组织,而且不易造成出血。对动物整个机体影响不太大,可进行长时间观察,而且这个部位易于进行显微镜下观察。因此,背斜方肌对于研究血管活性物质和机体对药物的应答反应是非常方便和理想的。

背斜方肌又称脊肩胛肌,是成对的肌肉,它纵伸于背部到腰部,它的肌纤维自第4胸椎至第3腰,并向两边伸展至肩胛线,它的神经支配来自脊副神经和第2、3颈部神经。它的供血来自腋动脉的肩胛下支和颈表浅动脉有肌肉分支。它的静脉注入前颈静脉。

实验采用大白鼠或金黄地鼠,体重70~120g,高于120g体重的鼠其背斜方肌过大过厚,不利于照明。用30mg/100g剂量戊巴比妥钠麻醉。将动物背部去毛、消毒。自颈部至腰部沿脊柱中线作皮肤切口。剥离结缔组织,用小虹膜剪将肌肉筋膜轻轻剥离,在肌肉侧面作一小小切口并用小弯剪轻轻剥开肌肉游离面(沿肩胛线),将小剪伸向肌肉底部将其完全与底层肌肉剥离。如遇有一两支小血管可以用4号将线结扎。这样便可得到一个宽为1.5cm左右的游离肌肉瓣。观察时使动物侧卧,将肌肉游离边用细大头针固定于特制灌流盒上(与金黄地鼠灌流盒类似)。用含有1%明胶的林格氏液灌流。用NaHCO3将pH调为7.35,灌流液保持35~37℃。

利用脊斜方肌制备可进行低倍、高倍、水镜、油镜观察。可以进行极漂亮的电影拍摄,可以清晰地分辩粘附于管壁的白血球。可以进行各种药物作用的研究,尤其适于微电极插入或微传感器插管进行在体微血管压力和微血流测定。

(五)颊囊微循环观察法

实验选用叙利亚种金黄地鼠,雄性,体重90~120g,在动物口腔两侧后角各有一颊囊供贮存食物之用。颊囊组织与皮肤组织相似。是由纤维结缔组织、鳞状上皮、骨骼肌、疏松结缔组织四层构成。颊囊的伸缩性很大,其容量可由1~2ml扩张到5~6ml。颊囊血供丰富,有致密的微血管网,是各种口径的微血管高度集中之地。颊囊组织薄而嫩,颜色淡,透光性好,微血管清晰,制备简单,既可作急性实验,也可作慢性连续观察实验,而且由于它是双侧对称器官,有些实验过程可在同一动物身上进行自身照射。

1.颊囊的简单制备 实验时,动物腹腔注以2.5%戊巴比妥钠30mg/kg体重进行麻醉。然后将口腔打开,沿一侧颊边轻轻伸进中号钝头镊子,伸到肩部时夹住颊囊盲端,从口中取出内面翻于外的盲囊,以滴管用37℃左右的生理盐水冲净其上的食物残渣,将颊囊展平,用弯形大头针固定于以透明有机玻璃制作的颊囊灌流盒上。启动恒温灌流系统并将灌流盒置于显微镜下,即可以透射光观察颊囊上微血管各项指标(放大100倍以下)。如观察需放在100倍以上进行,则需制备单层颊囊。此时颊囊上选择一个毛细血管网最少的区域,剪一个小切口。如需大面积观察则可沿颊囊动脉平行部分作纵长切品,在切口边缘部尚可作小小横切(垂直向两边)。其后用小虹膜剪在解剖镜下将疏松结缔组织移去。经过这样制备的颊囊,在显微镜下成象更加清晰。

2.颊囊的恒温灌流 颊囊灌流盒底板形态如图10-11所示,是一个24×18cm2的透明有机玻璃板,板上固定以直径为6cm、高为0.8cm的圆槽,槽中套以直径为4cm、高为0.4cm的开口双层环槽。环槽中灌以弹性透明硅橡胶,由圆槽一边底部输入恒温灌流液,另一端输出灌流液。灌流液的pH应调为中性(pH=7.35)并通过氧气。灌流液的温度以控温仪或以恒温水浴控制在37℃。整个实验过程中,恒温灌流液以慢速徐徐通过颊囊表面及底面。

金黄 地鼠颊市灌流装置

图10-11 金黄 地鼠颊市灌流装置

3.颊囊小室制备法

颊囊小室由底板和顶板组成,两板面积相同(直径为2~2.5cm)。顶板边缘有凹槽,中央有圆窗,圆窗粘以极薄的透明有机玻璃或云母片。底板由较薄的透明有机玻璃作成。两板在相应部位各有两个小孔。底板两孔处固定两个有机玻璃的小楔子,可穿进顶板上的两孔。

动物麻醉后,刮去一侧颊部、颈部及肩部的毛。先将颊囊从口内取出,以生理盐水冲洗净并放回。之后将小室底板用镊子轻轻塞入左侧颊囊,尽可能送到颊囊盲端。使动物右侧卧、固定。消毒皮肤,透过皮肤可触到入在颊囊中的底板的两楔,用消毒手术器械在两楔间皮肤作一小切口,并小心扩展切口到底板直径长。剥离结缔组织,使覆盖有颊囊膜的底板完全暴露于解剖镜下,用虹膜剪将膜上疏松结缔组织清除。注射不能损伤血管。为防止组织过干或发生血瘀,上述步骤要尽速进行。

上述步骤完毕后,于底板颊囊上滴以生理盐水,将1mm2的肿瘤组织块轻轻入于颊囊膜中央,迅速将顶板的两孔穿进底板两楔、盖紧(防止气泡进入),然后于每一楔孔滴以有机粘合剂,此时,于两板间形成一个小室,在此小室中肿瘤组织可生长。将皮肤切口边缘先以普通缝线穿一圈,再紧紧扎入顶板侧槽。于小室周围敷以胺黄粉。小室制备即完成。为防止感染,给动物每日肌内注射2500单位的多粘菌素B,3~4天。

利用颊囊小室法可进行多种恶性肿瘤移植的研究,如乳腺癌黑色素瘤、血管周期细胞瘤、神经鞘瘤等,并可于瘤组织植入后任何时间透过小室以显微镜观察瘤组织周围血管再生及发育情况和特点。

(六)缝匠肌微循环观察法

实验选用猫。猫的缝匠肌是一种可以用于进行离体实验或在体透明实验的最好的肌肉。可以用以进行正常微血流、微血压、充血、出血以及胃骼肌微血流调节的研究。

缝匠肌是大腿内侧表浅肌肉,它起于髂前上棘,终于胫骨近端和髌骨。其内缘之下正是股动脉和股静脉,有9cm长,4cm宽,由它可取得平均5g重的离体肌肉。

缝匠肌的供血由侧旋股动脉及股动脉分支而来,其远端尚有下行膝动脉供血。

实验时,动物以75mg/kg体重剂量的α-氯醛醣静脉注射麻醉。动物侧卧位固定,将其一腿(下部的)伸展。净皮,去毛并消毒,沿大隐静脉走向自腹股沟下1cm处至膝内侧作皮肤切口,轻轻剥离皮肤。其后,于大腿内缘与该切口相平行作另一切口。尽可能将皮肤剥离以暴露更大面积的肌内。露暴软组织以恒温灌流液浸透的纱布湿敷。在将缝匠肌中间部位的筋膜、结缔组织剥离完全后,便可以用冷光束照明装置伸于缝匠肌正中底部,并于显微镜下观察该肌肉上的微血流和进行各种测定。

如要取得离体缝匠肌,需在上述步骤之后先将缝匠肌周围小血管一一结扎,只留下由大隐静脉和股动脉、股静脉而来的主要分支。此后,进行股动脉分支与股静脉分支插管(一支输入,一支输出)待插管圆满完成后将其它所有血管结扎(包括大隐静脉来的所有血管)。然后将肌肉两端以特制的小夹子夹住。从夹子外缘剪下,离体的肌肉挂在一个铝制支架上置于恒温,恒温装置可于显微镜下进行各种灌流实验。一块6g重的肌肉,其血液灌流量通常0.2~0.3ml/分。好的肌肉制备可连续维持6小时以上的实验。

(七)肠系膜、大网膜、肠壁微循环观察法

远在200年前就有人将肠系统、大网膜的微循环进行了显微镜观察。因为它最易取出,并且血管清晰。小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠、家兔、猫、狗等动物的肠系膜和大网膜及肠壁皆可用于微循环观察,并且无明显差别,所用动物不宜过老,否则脂肪过多影响观察。Zweifach认为:回盲部肠系膜是最好的微循环观察区。因为它具有区域小而局限、没有肠蠕动、取出时不易损伤、脂肪组织少等优点。

实验时,动物麻醉同前。消毒腹部一侧皮肤,剪一个1~2寸的切口。动物侧卧于灌流盒边。取出欲观察的肠系膜或大网膜部位,轻轻伸展于透明有机玻璃制成的灌流盒上进行恒温灌流;灌流时流与滴相结合,灌流液用磷酸缓冲液调至pH7.2~7.35。灌流液中亦可加入白蛋白,使其成为1%白蛋白液。灌流液原瓶中通以O2和5%CO2

在进行肠系膜微循环观察时,要特别注意维持动物体温恒定。因为过冷或过热都要引起不正常的肠蠕动,影响实验效果。为此,必须监测动物肛温或口温。连续记录体温曲线。动物最好躺在电热垫上并盖以小被维持恒定的正常体温。一般说来,一切条件保持得好,可连续进行两小时以上的正常实验,也可能5~6小时都保持平衡,应该停止实验的早期信号是:肠系膜上收集静脉中出现白细胞附壁粘着现象;其后是红血球渗出。因之,如不维持严格的恒温灌流和保持恒定的体温,所进行肠系膜的微循环动态记录肯定是不客观的。

家兔肠系膜微循环观察时,以乌拉坦或戊巴妥纳静脉注射麻醉后,背住缚于兔板上(有加温装置),剪去腹部之毛,沿腹中线作一长6~8cm的切口进入腹腔。将上腹腔脏器推向右侧,于腹腔左上方找到回盲交界处(回肠为浅红色,结肠为灰色)在该部位上的上段轻轻拉回肠袢约10cm,将该段肠管及系膜通过有机玻璃流盒的后侧壁凹槽和裤形装(见图10-12),然后浸入充满38℃灌流液的小盒中,并轻轻把肠系膜平铺在灌流盒的中央圆合上,用大头针将肠系膜固定于中央圆台内侧边的软木片上。将腹壁、浆膜层和肌层缝合,并把切口右缘皮肤缝合固定于灌流盒侧壁的锁眼处。

检查家兔肠系膜微循环灌流盒

图10-12 检查家兔肠系膜微循环灌流盒

灌流盒右侧壁有一进水管与盛满任一台氏营养液的恒温压灌流瓶相连接,使营养液不断地流经小盒而自左侧壁的出水管口流出。以80W高压水银灯的光束投照平铺在中央圆台上的腹系膜上,双目显微镜放大40~80倍,可进行肠系膜血管口径、血流速度和血流状态观察。为了防止造成肠系膜的局部血流障碍和游斑性出血,要避免过分牵拉或摩擦肠系膜,要不断向肠系膜上滴加温热的生理盐水,避免干燥刺激。

(八)提睾丸微循环观察法

实验采用雄性大白鼠,体重80~110g,小于80g的大鼠提睾肌太小不利于制备,大于110g的大鼠太老,结缔组织增生,不利于观察。以25mg/kg体重剂量的戊巴比妥纳麻醉大鼠,或以130mg/100体重剂重的乌拉坦肌注(经常注入股田头肌)。将手术区域剃毛、洗净、消毒,最好进行气管切开,插管以保证呼吸顺利。进行股动脉插管测动脉压或准备静注药物。手术器械进行消毒。手术时,先用针在手术侧阴囊远端穿以缝线,将缝线固定在动物固定板的小钉上。然后在阴囊上作纵切口,切开皮肤、筋膜,轻轻剥离。将切口慢慢延长到离腹沟5~8mm处。用胶体林格氏液(pH7.35)开始轻轻灌流,于剥离的软组织上敷一层灌脱脂棉絮,棉絮浸以灌流液。将皮肤切口之每边穿两根丝线固定于动物板上。如图10-12所示,继续游离提睾肌,使之脱脑周围组织。将提睾肌轻轻作纵向切开并将其轻轻与睾丸剥离。用两个外科结扎连接睾丸和提睾肌的小血管,从两结中间剪断。如图10-13所示沿副睾纵柚将附睾系膜剪开。将睾丸和附睾经腹股沟环轻轻送入腹腔。提睾肌周围等距穿进5~6根丝线。动物仰卧,将提睾肌展铺于特制的马蹄形透明有机玻璃柱上,柱周围有等距的5~6个小钵,可将丝线结于钉上固定提睾肌。透明柱可调高低,其周围为恒温灌流盒(与金黄地鼠颊囊灌流装置相似)。

分离提睾肌方法

图10-13 分离提睾肌方法

提睾肌极薄,其上有各种口径的微血管,成像清晰,适于进行各种微循环参数测定,尤其独特的是提睾肌上最微细的毛细血管网也特别清楚,适于进行管腔、管壁动态变化和微血管与组织间物质交换的研究。也可用染料或荧光示踪剂进行淋巴微循环的研究。

五、几种简便常用的微循环障碍动物模型复制方法

(一)高分子右旋糖酐(HMWD)法

选择2~3公斤的健康家兔,雌雄不限。复制模型当天禁食、禁水。实验前观察眼球结膜微循环,采用微血管光滑、血流正常的动物,于清醒状态下复制模型。HMWD是一种多聚化合物,它能在红细胞间形成较多的稳定的间桥,表面桥力大于原来的电荷排斥力,从而造成红细胞聚集;加之其本身又是一种高粘度物质,还可增加血粘度。将平均分子量为20~40万的HMWD配成10%生理盐水溶液,以7~15ml/kg体重的剂量给家兔作耳缘静脉快速推注,如在用药同时作动物球结膜微循环活体观察,则可见到球结膜微循环中出现逐渐加强的血流缓慢,血细胞聚集,最后出现流动中的血细胞团块。用药前家兔眼球结微膜血管中的微动脉和毛细血管呈树枝状分布,微静脉常与微动脉平行,血管由粗到细,光滑均交,微血流呈带状或线状,偶可见到流动很快的粒线状血流,但不会有血细胞聚集的颗粒状血流出现。微动脉因血流较快呈线带状,常常不易看清其中的血细胞流动;毛细血管,特别是近瞳孔处的毛细血管网的血流常呈粒线状流动。正常时微血管周围无出血及渗出,因此微血管背景较白(巩膜),视野清晰。用药后,眼球结膜微循环中可见下列典型的急性微循环障碍表现:①毛细胞血管和微静脉中红细胞流速明显减慢,因此血流呈断线状、虚线状或粒状,局部区域甚至完全停滞;②微血管中出现明显的血细胞聚集,严重时见流动中的血细胞团块;③有时尚可见到微血管发生轻度痉挛,微血管周围有渗出和出血以及微静脉中有血细胞贴壁翻滚的现象。用药后24小时内,上述急性微循环障碍表现最严重,少数动物可因急性栓塞而突然死亡,也有少数动物出现偏瘫症状。存活者,如经仔细护理,则72小时后HMWD破坏、排泄,微循环障碍逐渐好转。经测定,在此种急性微循环障碍模型中,动物血粘度明显升高,红细胞电泳变慢,血沉加速。

这种急性微循环障碍动物模型的复制方法简便,出现快,成功率高(95%以上),适于探索与急性微循环障碍有关的各种疾病的发病机制及药物作用原理的研究。

(二)胎儿羊水静脉注射法

给家兔以1~4ml/kg体重的剂量静脉注射新鲜的胎儿羊水,可复制成急性微循环障碍动物模型。对注射动物进行活体微循环观察时发现,注射完毕时,即有血细胞流动速度减慢,毛细血管中可常见到微血流的间歇性流动,呈红白交替现象,在微静脉或较大的毛细血管中还常可见到随血流流动的透明细胞(可能为羊水细胞),20分钟后,微血流明显淤滞,局部出现凝血,微循环和较大的毛细血管中出现体积逐渐加大的白色团块,这可能是流动中的白色血栓(以羊水细胞为核心构成血栓)。注后1小时左右,大部分微血管停止流动,仅有部分微血管中可见血流缓慢移动,而且常可出现栓塞所致的突然死亡。这种急性微循环障碍动物模型的复制成功率,常随羊水的质量而异。

(三)兔脑粉浸出液静脉注射法

取新鲜兔脑粉100mg,加生理盐水5ml,50℃温箱孵育20分钟,取上清液备用。给家兔耳缘静脉推注上述溶液,剂量为1~4ml/kg体重,同时可给1/4m CaCL24ml,必要时还可添加少量乳酸静脉注射。

球结膜微循环观察所见与HMWD复制的模型类似。此法最大的缺点是剂量不易控制,每个动物对兔脑粉浸出液(代替凝血酶)的敏感程度不一,用量太小,急性微循环障碍表现不显;剂量稍大,动物可发生突然死亡,必须十分注意。

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