第四节 ELISA的技术要点

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ELISA的技术要点包括三个方面:试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。

一、试剂的制备

ELISA的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。以下叙述这些试剂的原料和制备方法。

(一)固相载体

可作ELISA中载体的物质很多,最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料,可制成各种形式。在ELISA测定过程中,它作为载体和容器,不参与化学反应。加之它的价格低廉,所以被普遍采用。

ELISA载体的形状主要有三种:小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器,最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球,表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器,在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗,效果更好。最常用的载体为微量反应板,专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板,国际通用的标准板形是8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测,有制成8联或12联孔条的,放入座架后,大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测,并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的ELISA检测,包括加样、洗涤、保温、比色等步骤,对操作的标准化极为有利。

良好的ELISA板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工艺的差别,各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/ml)包被ELISA板各孔后,每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗人IgG抗体,保温后洗涤,加底物显色,终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10%。

与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体,聚氯乙烯板的特点为质软板薄,可切割,价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值有时也略高。

为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣,可用以下方法加以检验:用其它免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后,在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定,然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大,这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。

除塑料制品外,固相酶免疫测定的载体还有两种材料:一是微孔滤膜,如硝酸纤维素膜、尼龙膜等,这类测定形式将在本章第五节“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的,反应时固相微粒悬浮在溶液中,具有液相反应的速率,反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段,洗涤也十分方便,但需配备特殊的仪器。

(二)抗原和抗体

在ELISA实施过程中,抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高,抗体效价高、亲和力强。

ELISA所用抗原有三个来源:天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等,一般含有多种抗原成分,需经纯化,提取出特定的抗原成分后才可应用,因此也称提纯抗原(purifiedantigen)。重组抗原(recombinantantigen)和多肽抗原(peptideantigen)均为人工合成品,使用安全,而且纯度高,干扰物质少。因此虽然制备合成抗原有较高的技术难度且要求较为昂贵的仪器设备和试剂,其应用仍十分普遍,特别是对那些天然抗原不易得到的试验,更显出其独到之处。

用于ELISA的抗体有多克隆的和单克隆的。抗血清成分复杂,应从中提取IgG才可用于包被固相或酶标记。含单克隆抗体的小鼠腹水中的特异性抗体含量较高,有时可适当稀释后直接进行包被。制备酶结合物用的抗体的质量往往要求有较高的纯度。经硫酸铵盐析纯化的IgG可进一步用各种分子筛层析提纯。也可用亲和层析法提纯特异性IgG,如用酶消化IgG后提取的Fab片段,则效果更好。

(三)免疫吸附剂

固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)。由于载体的不同,包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体,通常将抗原或抗体溶于缓冲液(最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液)中,加于ELISA板孔中在4℃过夜,经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低,固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖,其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面,最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下,如在包被后再用1%~5%牛血清白蛋白包被一次,可以消除这种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。

(四)酶和底物

ELISA中所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定,继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定,光吸收高。ELISA中最常用的酶为辣根过氧化酶(HRP)和从牛肠粘膜或大肠杆菌提取的碱性磷酸酶(AP)。

HRP在蔬菜作物辣根中含量很高,纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白,含糖量约18%;分子量为44kD;是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白,在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环,在403nm波长处有最高吸收峰。HRP催化下列反应:

上式中DH2为供氢体,H2O2O为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高,除H2O2外,仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体,作为试剂较H2O2方便。许多化合物可作为HRP的供氧体,在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺(orthopenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。

OPD为在ELISA中应用最多的底物,灵敏度高,比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差,而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色,目测对比鲜明;加酸停止酶反应后变黄色,可在比色计中定量;因此应用日见增多。ABTS,虽然灵敏度不如OPD和TMB,但空白值很低。HRP催化OPD的反应如下:

HRP的纯度用RZ(ReinheitZahl,意为纯度数)表示,是403nm的吸光度与280nm的吸光度之比,高纯度的HRP的RZ≥3.0。应注意的是酶变性后,RZ可不变而活力降低,故重用酶制剂时更重要的指标为活力。酶活力以单位表示:1min将1μmol的底物转化为产物的酶量为1个单位。

在ELISA中另一常用的酶为碱性磷酸酶。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD,酶作用的最适pH为8.0;用小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kD,最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作为底物。它可制成片状试剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一段时间。反应式如下:

在ELISA中应用AP系统,其敏感性一般高于应用HRP系统,空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂,稳定性较HRP低,价格较HRP高,制备酶结合物时得率较HRP低等原因,国内在ELISA中一般均采用HRP。

除HRP和AP以外,在商品ELISA试剂中应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-D半乳糖苷(4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside),经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮(4-mehtylumbelliferone),可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定,而且如用固相载体直接作为测定容器,此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变,可使指示剂变色;另外,在人体内没有内源酶(酶的化学发光底物见第十八章)。

(五)结合物

酶标记的抗原或抗体称为结合物(conjugate)。抗原由于化学结构不同,可用不同的方法与酶结合。如为蛋白质抗原,基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。

1.戊二醛交联法戊二醛是一种双功能团试剂,可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法(如连接AP),也可用二步法(如连接HRP)。举例如下:

2~5mg纯抗体与5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸缓冲液1ml中,4℃下对同上缓冲液透析平衡。磁力搅拌下,缓慢加入1%戊二醛0.05ml,在室温下放置2小时。在4℃下对0.05mol/LpH8.0Tris缓冲液透析平衡,即得酶标抗体。

辣根过氧化物酶可溶解于50%饱和度硫酸铵中。用上法交联后可用50%饱和度硫酸铵沉淀酶标抗体,弃去上清中游离酶。

戊二醛一步法操作简便、有效,而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格,大小也不一,影响效果。

制备HRP抗体结合物也可用二步法,即先将HRP与戊二醛作用,透析除去戊二醛,在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。

2.过碘酸盐氧化法本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物,过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠(NaBH4)中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼,可与蛋白质结合,形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈,各批实验结果不易重复。

按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过洗涤,非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多,分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简便,但效果不如用SephadexG-200凝胶过滤的好。

二、最适工作浓度的选择

在建立某一ELISA测定中,应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择,以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例,介绍最适工作浓度的选择方法。

(一)间接法测抗体

1.酶标抗抗体工作浓度的选择

(1)用100ng/ml人IgG进行包被,洗涤。

(2)将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中,保温、洗涤。

(3)加底物显色。加酸终止反应后,读取吸亮度(A),绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度,作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。

2.棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度

(1)用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被,洗涤。

(2)将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释,加样,保温,洗涤。

(3)加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体,保温,洗涤。

(4)加底物显色。加酸终止反应后读取A值。

(5)选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果,表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。

表15-1 间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择

各类血清抗原稀释度
1:501:1001:2001:4001:800 
强阳性1.201.040.840.680.42
弱阳性0.640.410.300.220.19
阴性0.230.130.080.660.05
稀释液0.090.020.020.020.04

(二)夹心法测抗原

在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度,举例如下(表15-2):

表15-2 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择

包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度参考抗原
强阳性(25ng/ml)弱阳性(1.5ng/ml)阴性
10μg/ml   
1:10001.170.150.09
1:50000.460.030
1:250000.1200
1μg/ml   
1:1000>20.250.10
1:50000.910.120.01
1:250000.250.010
0.1μg/ml   
1:10000.420.130.13
1:50000.110.030.02
1:250000.0300

(1)抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml,分别在ELISA板上进行包被,每一浓度包括三个纵行,洗涤。

(2)在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液,另一横行加入弱阳性抗原液,第三横行加入阴性对照液,保温,洗涤。

(3)将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度,例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中,保温,洗涤。

(4)加底物显色。加酸终止反应后,读取A值。

(5)以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件,据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml,酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂,可以此浓度为基点,缩小间距再做进一步的棋盘滴定。

三、测定方法的标准化

要使ELISA测定得到准确的结果,不论是定性的还是定量的,必须严格按照规定的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述,其他一般性试剂,如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等,配制时不可掉以轻心。缓冲液可于冰箱中短期保存,使用前应观察是否变质。蒸馏水的质量在ELISA中也至关重要,最好使用新鲜重蒸馏的。不合格的蒸馏水可使空白值升高。

测定的实施中,应力求各个步骤操作的标准化,下面以板式ELISA为例,介绍有关注意事项。

(一)加样

在ELISA中除了包被外,一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性,例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管,保持准确的加样姿势,使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底,避免加在孔壁上部,并注意不可出现气泡。

(二)保温

在ELISA中一般有二次抗原抗体反应,即加标本后和加结合物后,此时反应的温度和时间应按规定的要求,保温容器最好是水浴箱,可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发,板上应加盖,或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的,传热容易。如用保温箱,空湿盒应预先放在其中,以平衡温度,这在室温较低时更为重要。加入底物后,反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃,ELISA板可避光放在实验台上,以便不时观察,待对照管显色适当时,即可终止酶反应。

(三)洗涤

洗涤在ELISA过程中不是反应聚,但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯(吐温,Tween)一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯,为非离子型的表面张力物质,常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号,结合月桂酸的为聚山梨酯20,在ELISA中最为常用。它的洗涤效果好,并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。

洗涤如不彻底,特别在最后一次,如有酶结合物的非特异性吸附,将使空白值升高。另外,在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净,也将与酶标抗体作用而产生干扰。

ELISA板的洗涤一般可采用以下方法:①吸干孔内反应液;②将洗涤液注满板孔;③放置2min,略作摇动;④吸干孔内液,也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3~4次,有时甚至需洗5~6次。

(四)比色

如阴性对照颜色极浅,在定性测定中一般可采用目视比色。如用比色计测定结果,准确性决定于ELISA板底的平整与透明度和比色计的质量。

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