第八节 脂蛋白和脂质测定方法学评价

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血浆脂蛋白和脂质测定是临床生化检验的常规测定项目,其临床意义主要是:早期发现与诊断高脂蛋白血症;协助诊断动脉粥样硬化症;评价动脉粥样硬化疾患如冠心病脑梗塞等危险度;监测评价饮食与药物治疗效果。

一、血浆脂蛋白测定

⒈超速离心分离纯化法超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白的比重(密度)的差异,在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。

血浆在不同密度盐溶液中经过超速离心,各种脂蛋白可按密度大小漂浮于不同盐溶液介质中。脂蛋白漂浮的衡量单位是漂浮率(Sf)。Gofman等于1950年确定,血浆脂蛋白在比重为1.063的NaCl溶液中(26℃),每秒每达因(ldyn=10-5N)克离心力的作用下的漂浮速度,称为1个Svedbery单位(10-13s)。Sf越大,脂蛋白密度越低。

一般操作方法是将血浆置于已准备好的不同密度梯度的盐溶媒介质中,在强大离心作用下,各脂蛋白依其自身的Sf不同,分散于离心管中的密度梯度溶媒层,达到分离纯化的目的。

超速离心法是分离纯化脂蛋白的有效技术,目前广泛应用于脂蛋白、载脂蛋白代谢的研究中。

⒉电泳分离法不同脂蛋白因蛋白质含量不同、其电荷量不同,故可用电泳方法进行分离,并根据血浆脂蛋白电泳迁移率不同予以判断确认。电泳支持物一般常用醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶或聚丙酰胺凝胶。由于醋酸纤维薄膜要预处理,很繁杂,外加电泳时间过长,目前已很少使用。临床检验中主要采用琼脂糖凝胶电泳进行分离,快而较为准确,仪器设备要求不高,被广泛采用。聚丙烯酰胺凝胶作为支持物分离脂蛋白,值得推荐给临床使用。

电泳分离法不论用何种支持物,血浆脂蛋白需用亲脂染料如苏丹黑B等进行预染再电泳,电泳完毕,脂蛋白根据电荷量不同,移动在不同的位置,再置于光密度计内进行扫描,计算出各种脂蛋白的百分比,该数值乘以血浆总脂量,即可求出α-脂蛋白、β-脂蛋白和前β-脂蛋白含量,乳糜微粒停留在原点,无法测出其含量,正常空腹12h后,血浆中无CM存在。也可将电泳毕的琼脂糖凝胶脂蛋白区带切割置于试管中,加水溶解,进行比色,测出各自百分比,这一手工半定量法无法测准,属淘汰之列。

⒊沉淀分离法由于脂蛋白的组成及理化性质不同,在不同的聚阴离子和2价不同金属离子(Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+)以及不同pH值条件下,使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀,以达到分离定量各种脂蛋白的目的。

如肝素锰沉淀血清中VLDL和LDL,离心沉淀,HDL则留在上清液,再定量HDL量,即为血浆HDL的量。也可采用聚乙烯硫酸盐沉淀LDL,离心去上清液留沉淀,再定量沉淀其中的LDL,即血浆的LDL量。脂蛋白是一种既有蛋白质又有胆固醇,还有磷脂的复合体,如何定量,尚无一种较为理想的方法。目前仅以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据,即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇,并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)或极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)。这类测定方法是目前临床广泛使用的方法,快速并较为准确。

⒋遮蔽直接测定法利用脂蛋白中某种特异抗体等物质,先将血浆中LDL和VLDL包裹保护,不受测定胆固醇试剂的影响,而直接测定未被包裹的HDL中的胆固醇,在不离心分离条件下,测定出HDL的胆固醇含量,快速准确,是近年来发展的新技术,值得推广应用。

二、血清总脂质测定

血清总脂质主要包括FC、CE、PL和TG等。血清总胆质测定除作为脂质代谢紊乱及有关疾患的协助诊断外,还可用于血总脂增加的原发性胆汁肝硬化肾病综合征或急慢性肝炎以及血总脂减少的重症肝炎、肝硬化等的严重肝实质性损害、恶液质、甲状腺功能亢进和吸收不良综合征等疾患的协助诊断。

血总脂一般随年龄增加而升高,40岁以上者显着增加,65-70岁者反而降低。测定方法不同,正常参考值有一定的差异。

测定方法分两大类:一类是抽提法,将血清脂质通过脂质抽提剂提入某一介质中,再进行定量;另一类是直接测定法,即无需抽提。

⒈脂质抽提法脂质存在于血清脂蛋白中,利用甲醇或乙醇使其与蛋白结合的脂质分离,再利用甲醇或乙醇的非极性有机溶媒使脂质溶于其中。Bloor溶剂(醚:醇为1:3,V/V)或FovCh溶剂(氯仿:甲醇为2:1,v/V)的醚氯仿等非极性溶剂的混合液,可提高切断脂质与蛋白质的结合的能力,达到抽提的目的。血清脂质抽提入有机溶液后,蒸发干固,除去有机溶液,通过加热氧化,再显色定量。

⒉脂质直接测定法如Sulfo-phospho-Vanillin法是加浓硫酸入血清加热,冷却后,加试剂显色(即SPV反应)直接测定出血清总脂质。

三、胆固醇测定

血清中胆固醇包括CE和FC,酯型的CE占70%,游离型FC占30%。FC中的C3的-OH在LACT作用下,可分别与亚油酸(43%)、油酸(24%)、软脂酸(10%)、亚麻油酸(6%)、花生四烯酸(65)、硬脂酸(3%)等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多,其次是HDL和VLDL,CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

⒈化学法化学法一般包括:①抽提;②皂化;③毛地黄皂苷沉淀纯化;④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法,包括①到④步骤操作过程,常规操作中多省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法,现将此法作为标准参考方法予以利用。

⒉酶法测定CE在胆固醇酯酶(cholesterolesterase,CHE)作用下水解成FC和FFA,FC再经胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase,COD)氧化成△4胆甾烯酮和H2O2,再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量,或者△4胆甾烯酮生成量,以作为FC的定量依据。该法是目前常规应用方法,快速准确,标本用量少,便于自动生化分析器作批量测定。

四、甘油三酯测定

甘油三酯又称中性脂肪,由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸,所以分别存在有甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)和甘油一酯(MG)。血清中90%~95%是TG,TG中结合的脂肪酸分别为油酸(44%)、软脂酸(26%),亚油酸(16%)和棕榈油酸(7%)。

血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。

血清中TG的化学组成并不单一,准确求其分子量较为困难。因标准不同,测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精(软脂精)(分子量807.3)、三油精(分子量895.4),按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。

⒈化学法化学测定法包括:①TG的抽提分离;②皂化;③甘油糖的氧化;④氧化生成甲撑显色定量等四个阶段。操作较为繁杂,影响测定因素太多,共法准确性差,一般很少用。

⒉酶法测定酶法测定包括:①TG的抽提与皂化;②加水分解生成甘油糖定量两个阶段。目前常规检测应用的方法有甘油激酶(glycerolkinase,GK)法和甘油氧化酶(glyceroloxidase,glyod,GOD)法。操作简便,快速准确,并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。

五、磷脂测定

磷脂(PL)并非单一的化合物,而是含有磷酸基和多种脂质的一类物质的总称。

血清中PL包括:①卵磷脂(60%)和溶血卵磷脂(2%-10%);②磷脂酰乙醇胺等(2%);③鞘磷脂(20%)。

血清PL定量方法包括测定无机磷化学法和酶法两大类。

⒈化学测定法包括①抽提分离;②灰化;③显色、比色三个阶段。

⒉酶测定法可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用,加水分解,测定其产物,对PL进行定量,一般多采用磷脂酶D(PL-D)。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及胆碱的磷脂,这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。该法快速准确,便于自动化仪器进行批量检测。

六、游离脂肪酸测定

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(FFA)。正常血清中含有油酸(C18:)占54%,软脂酸(C16:1)占34%,硬脂酸(C18:1)占6%,是其主要的FFA。另外还有月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)和花生四烯酸(C20:1)等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较,FFA在血中浓度很低,其含量水平极易受脂代谢、糖代谢和内分泌功能等因素影响,血中FFA半寿期为1-2min,极短。血清中的FFA是与清蛋白结合进行运输,属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清FFA法有滴定法、比色法、原子分光光度法、高效液相层极法和酶法等。一般多以酶法测定。作FFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在,极易也极快速使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中FFA值上升。贮存的标本仅限于24h内,若保存三天,其值约升高30%,使结果不准确。

⒈非酶法确定非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高效液相层析法。前三种方法准确性差,高效液相层析法仪器太昂贵,不便于批量操作。

⒉酶测定法血清中主要用脂肪酶测定。可分别测定产物乙酰CoA、AMP或辅酶A(CoA),进行定量。酶法测定结果准确可靠快速,易于批量检测。

七、载脂蛋白测定

血清载脂蛋白(Apo)包括ApoAⅠ、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、E和(a),已属常规检测项目。血清中载脂蛋白均结合于脂蛋白中,测定时要加用解链剂,使脂蛋白中Apo暴露再进行测定。

目前测定血清中Apo的含量的方法是利用相应特异抗体试剂进行测定。现有羊抗人ApoAⅠ、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、E和(a)等抗体试剂。测定原理是将某一特异抗体加到待测人血清中,即与血清中相应抗原形成抗原抗体复合物,根据复合物的量,即可测出血清中某一Apo含量。例如在人血清中加入抗人ApoAⅠ抗体,即与血清中ApoAⅠ(抗原)结合形成复合物,再定量即可测出血清中ApoAⅠ含量。

⒈免疫扩散法先制备含Apo抗体的琼脂糖凝胶,间隔等距离打孔,加入待测人血清,水平置于温箱(37℃)保温24或48h,抗原从孔中间向周围扩散,因凝胶板中有相应抗体,经一定时间扩散后,最后在凝胶孔周围形成一圆型沉淀圈,测量其圆直径,以圆的面积大小计算血清中Apo含量。该法要求在测量圆周大小时,一定要精确到0.1mm。这一测定方法可适用于以抗体为试剂贩所有微量蛋白的测定,但易受多种因素的影响,难以测准,有淘汰的趋势。

⒉免疫火箭电泳先制备含某一Apo抗体的琼脂糖凝胶,靠近阴极端打孔,加入待测血清,进行电泳。血清中Apo抗原往正极移动,一定时间(约3h)后,即可形成类似火箭的沉淀峰,根据火箭峰高度或面积的大小计算血清中Apo含量。在严格掌握电泳条件下,本法是一种较为简便、试剂用量少的好方法。

⒊免疫比浊法免疫比浊法分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。

Apo的特异抗体与血清中相应的抗原结合形成抗原抗体免疫复合物,并形成微细颗粒,混悬于溶液介质中,光线通过这种浑浊介质溶液时被吸收一部分,吸收的多少与混浊颗粒的量成正比。在抗体量一定的条件下,抗原越多,抗原抗体复合物越多,溶液越浑浊,吸收光越多,以此对抗原进行定量,这种通过测定光吸收量的方法称为透射比浊法。该法是目前使用最为广泛的方法,快速准确,可在自动生化分析仪上作批量检测。

当光线通过含抗原体复合物的浑浊介质溶液的混悬颗粒时,出现光散射作用,散射光强度与溶液中混悬颗粒的量成正比,这种测定光散射强度的方法称为免疫散射比浊法。该法的进行,需要有具备测定散射光的仪器如散射比浊仪等。

免疫比浊时,由于抗原与抗体结合的过程中,吸收度与浓度之间不呈线性关系,一般是三次方程曲线关系。若要将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来,需要经过三次方程拟合成近似直线化的曲线方程,再进行运算。免疫比浊的实际操作过程中,可采用终点法或速率法,用五点或七点不同浓度进行定标,经三次曲线方程拟合求出一条能反映真实情况的浓度与吸光度的关系曲线方程,作为定量的工作曲线。如果以单一标准浓度定标,以一次方程直线回归运算,所测结果仅在标准浓度上下波动,真正的过低和过高值无法测准。

免疫比浊法所用抗体应是单价、特异并且高效价的,尤其是抗体若非单一而混有少量其他蛋白抗体,在血清中形成的复合物将是一种大杂烩,非单一蛋白的复合物,测出结果偏高而不准确。

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