第五节 治疗药物监测常用标本及预处理

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根据需测定药物的体内过程特点,选用合适的生物体液,在药动学理论及参数指导下确定适宜的时间取样,进行必要的预处理,以具高度特异性及灵敏度的方法,测定药物和(或)代谢物浓度,是TDM工作中最常规的工作。

一、常用标本及收集

⒈血清(浆)第一节中已谈到,在药物的体内过程中,血浆中的药物(血药)起了中央枢纽的作用,可视做药物体内变化的一面镜子,因此有关药动学的资料几乎均是通过对血药的研究获取的。另一方面,绝大多数药物在达到分布平衡后,虽然不是均匀分布,但血药浓度和靶位药物浓度成比例,故也和效应间存在量效依存关系。现已建立了不少药物的治疗血药浓度范围及中毒水平的群体资料,并且血液也易于采集。由于以上原因,血液是TDM工作中最常使用的标本。以血液为TDM标本时,测定血浆或血清中的药物均可,因为药物不和血浆纤维蛋白结合,许多药物的对比研究也证实了血浆和血清中的浓度相等。为避免抗凝剂与药物间可能发生的化学反应及对测定过程的干扰,TDM工作中通常以血清为检测标本。

大多数药物在血液中都程度不等地和血浆蛋白形成可逆结合,显然游离药物浓度和效应间的关系更密切。笼统地测定包括与蛋白结合部分和游离部分的总血药浓度,并不能反映各种原因所致药物血浆蛋白结合率改变而产生的游离药物浓度变化。虽然可通过详细的用药史询问,检测血浆蛋白浓度等方法,协助了解有无影响药物血浆蛋白结合的因素存在,从而在评价总血药浓度时加以考虑,但仍不可靠。尽管直接测定游离血药浓度操作繁杂,在TDM工作中仍日益主张直接测定游离血药浓度,特别是血浆蛋白结合率高的药物。因为此类药物血浆蛋白结合率的轻微改变,将导致游离药物浓度的明显变化而显著影响药效。但本书及文献中报告的有关药物的治疗浓度范围、中毒水平,除特别说明的外,仍是指血清(浆)药物总浓度。

血液标本通常在外周静脉采集。为了能正确反映整个体循环中的药物浓度,静脉注射或滴注用药时,不宜在同一静脉取血,特别是正滴入药物期间、注入药物后短期内或有外漏时。此外肌肉注射或皮下用药后,也应尽量避免在注射部位回流静脉取血。

⒉唾液唾液可无损伤地采集,为病人乐意接受。唾液中的药物除极少数种类可以主动转运方式进入外,大多是由血浆中未与蛋白质结合的游离药物,尤其是高脂溶性的分子态游离药物,以被动扩散的方式进入。另一方面,与血浆相比,唾液中蛋白量甚少,并且为粘蛋白、淀粉酶、免疫球蛋白等不与药物结合的蛋白质,因此唾液中的药物几乎均以游离态存在,并和血浆中游离药物浓度关系密切,用以反映靶位药物浓度较总血药浓度更适合。但是,唾液pH波动在6.2-7.6范围内,平均约6.5。唾液pH的波动将导致与稳定的血浆pH间的差值变动,从而改变药物在两种体液间产生不稳定的解离度和分配比,即唾液药物浓度与血浆游离药物浓度比值出现波动。此外,唾液分泌量及成分受机体功能状态影响,若处于高分泌状态,将产生大量稀薄唾液,一些扩散慢的药物将难以和血药达分布平衡。由于前述pH差异,一般中性或弱酸性药能较快进入唾液,达到分布平衡;而碱性较强的药物则相反,往往出现唾液中的药物浓度较血药浓度滞后的现象。鉴于以上原因,用唾液作TDM标本主要适用于下列情况:①已知唾液药物浓度与血浆药物浓度(总浓度或游离药物浓度)比值较恒定的药物;②在唾液与血浆间能较快达到分布平衡的药物,多数弱碱性、中性及在体内分布属单室模型的药物都属此;③本身或同时使用的药物应无抑制唾液分泌的M胆碱受体阻断作用。丙咪嗪等三环类抗抑郁药、氯丙嗪等吩噻嗪类抗精神分裂症药、苯海拉明等抗组胺药及阿托品等胃肠解痉药,都可抑制唾液分泌,改变唾液中药物浓度,并且收集唾液困难,所以不能用唾液作TDM标本。

有关唾液药物浓度与药物效应间关系的资料极少,因此以唾液为标本进行TDM时,结果的解释评价多通过建立唾液与血药浓度间的关系,再借助后者资料进行。

可用唾液作TDM的药物有对乙酰氨基酚、水杨酸类、苯妥英钠、苯巴比妥、氨茶碱、甲磺丁脲、锂盐等。特别是锂盐,虽是以主动转运方式进入唾液,其唾液浓度可为血浆的2~3倍,但对同一个体,达稳态浓度后,其二者间比值相当恒定,尤宜采用。

唾液标本的收集宜在自然分泌状态下进行。可采用自然吐出,或用特制的负压吸盘采集。咀嚼石蜡块等机械刺激可促进唾液排出,若以维生素C、柠檬酸等置于舌尖,虽可刺激唾液大量分泌,但因可降低唾液药物浓度,改变唾液pH及可能干扰测定,不宜使用。唾液采集后,最好立即测定其pH,以便供解释结果时参考。若为口服用药,应在口服后充分漱口,并不宜在服药后短期内取样,以免残留药物污染干扰。口腔有炎症时,炎性渗出物可能干扰测定,不宜用唾液作为TDM标本。

⒊尿尿液也可无损伤收集。尿中的药物除少数有机酸、碱类药可以在近曲小管被主动分泌入尿外,大多数药物(游离部分)都是从肾小球以滤过方式,由血浆进入原尿中。随着尿液生成过程中的浓缩,尿药浓度逐渐升高,大多远远高出血药浓度,因此易于测定,这也是其优点。

从理论上讲,以滤过方式从肾小球排泄的药物,任一时刻的排泄速率等于该药的肾清除率(Clτ)和该时血浆药物浓度(严格说应为游离药物浓度)(C)之乘积。一般(>τ)恒定,因此药物的尿排泄率与血浆药物浓度成正比。若分时段连续收集尿液,假设每时段内尿药平均排泄速率恰等于该时段中点时刻的排泄速率,则根据该时段平均尿药浓度(C)及尿量(Vu)和时间(t),可计算出该时段中点瞬时尿药排泄速率=C·VEN-US;mso-fareast-language:ZH-CN;msou/t。如果知道该药的Cl,便可求得该时段中点时刻的血药浓度。根据上述理论和方法,还可求得该药的消除速率常数k等有关药动学参数(参见有关药动学专著)。但上述假设与实际有差异,尿液生成不可能是均匀的,并且未考虑影响肾小管对药物重吸收的因素,特别是尿液pH改变对其中的药物解离度的影响所致被动扩散重吸收的变化。事实上,尿液pH随饮食成分、水电解质和酸碱平衡状态的改变而变化,可有较唾液pH更大的波动。因此,在TDM的实际工作中以尿为标本甚少。但对用作治疗泌尿道感染的药物,及可产生肾小管损害的药物,检测尿药浓度则有其特殊意义。

⒋其他体液直接测定脑脊液中的药物浓度,可排除血-脑屏障对药物分布的影响,并且脑脊液中蛋白质少,对作用于中枢神经系统的药物,更接近于靶位浓度。但因取样特别是多次取样难以实现,而有关脑脊液中药物的药动学资料少而不完全,故在TDM工作中不易推广。因同样原因,直接测定其它靶位组织或体液药物浓度,在TDM中也极少应用。

二、取样时间

TDM工作中取样时间对其测定结果的临床价值有较大影响,是开展TDM工作必须考虑的基本问题。应根据TDM的目的及病人具体情况,应用本章第二节中介绍的有关药动学理论,按以下原则确定取样时间。

(一)供计算个体药动学模型及参考

由于两点只能确定一条唯一的直线,此时血药浓度测定中的任何误差,取样时间是否得当,都将对药动学参数产生明显的影响。而血管外用药及多室模型残数法求药动学参数时,消除相方程的计算,都是假设时间t足够大,可不考虑吸收相和(或)分布相的影响而进行的。因此,取样时间的选定应遵循以下两个原则:①在有关血药浓度随时间变化的指数方程中,每一指数项取样不得少于3点,即每一相直线方程的确定至少得有3个或更多的点,此外,在药-时曲线中有关相转折点附近至少有两个点,以便较准确地判明转折点;②消除相取样时间尽量长,时间跨度至少超过两个半寿期。

实际工作中,可根据上述原则,参考有关药物的群体药动学模型及参数资料,具体确定取样时间。理想的是能在一次用药后即连续完成全部取样。若条件不许可,可考虑多剂给药后分次取样累积法,即在多剂用药时,参照群体资料,估计达稳态后,再分别在每剂用药后不同时间取样。假设在取样期间内各药动学参数不发生变化,将每次给药前血药浓度即(Cssmin视做零,则可将这些点累积起来,视做一次用药间隔时间内的不同时点处理。此时每次取样时间的选定仍按上述原则进行。但本法较不可靠,特别是消除半寿期接近甚至大于给药间隔者,误差更大。

(二)监测、调整用药方案

应在达稳态浓度后再取样。恒速静脉滴注时,稳态血药浓缩维持在一几乎恒定的水平,因此,只要达稳态后,任何时间取样测定均可。而多剂间隔用药时,稳态血药浓度将波动在一定范围,测定峰值浓度还是谷浓度,应根据临床需要决定。

⒈了解是否达有效血药浓度水平用于控制症状发作、巩固疗效的长期用药,如苯妥英钠控制癫痫大发作等,不能在短时期内靠临床表现作出判断,需依靠TDM回答。这种情况下,若已知病人个体药动学参数,则可在一个给药间隔内的达峰时间(tp)及下次用药前,分别取血测定(Cssmax和(Cssmin,观察二者是否均在有效血药浓度范围内。二室模型药物(Cssmax应为消除相起始段。如果病人个体药动学参数未知,仅参考群体资料制定的用药方案,则群众资料的平均达峰时间tp不一定代表具体病人的tp。但无论如何,任何药物、任一个体每次用药前总是(Cssmin,所以,此时最好仅在给药前取样测定(Cssmin,根据(Cssmin与有效血药浓度范围,特别是下限的关系,调整剂量。

⒉确定是否会致慢性中毒对已达疗效但需了解是否可能产生潜在的慢性毒性作用时,应在tp取样。若不知个体的tp,可在群体tp均值及相邻前后时间分别取样测定,以较可靠地了解血药浓度是否接近或超过最小中毒浓度。

(三)急性药物中毒的诊断及处理

对于前后应立即取样测定,后者则可根据临床需要,在必要时取样,以监测抢救效果。

三、样品预处理

TDM工作中,除少数方法可直接应用收集的标本供测定外,大多需进行必要的预处理。预处理的目的是在不破坏欲测定药物的化学结构的前提下,用适当的方法尽量减少干扰组分,浓缩纯化待测物,以提高检测的灵敏度及特异性,并减少对仪器的损害。预处理包括去蛋白、提取和化学衍生化。

(一)去蛋白

TDM常用的血清(浆)、唾液或尿液等都或多或少地含有蛋白质,并对多种测定方法构成干扰,还可造成仪器污染、损害。去蛋白的方法有沉淀离心法、层析法、超滤法和超速离心法等。其中以沉淀离心法最为简便快捷,并且结合提取的要求,选用合适的酸、碱和有机溶剂,与提取同步进行,故最常选用。由于药物和血浆蛋白的结合,大多是通过离子键、氢键、VanderWaals引力等较弱的作用力形成。当使蛋白质变性沉淀时,这种结合也同时被破坏,释放出药物,因此用沉淀离心法去蛋白处理的体液标本,最后测得的药物浓度应是包括游离药物和与蛋白结合的药物两部分的总浓度。显然,若需要单独测定游离药物浓度时,不能采用此法,而应选用温和但较繁杂、耗时的层析法、超滤法或超速离心法。这样既可去除蛋白,又不至使蛋白结合的药物释出。

(二)提取

为了尽可能选择性地浓缩待测组分,以提高检测的灵敏度,并改善检测方法的特异性,减少干扰,除免疫化学法外,TDM使用的多数检测方法均需进行提取。提取方法有液-液提取和液-固提取两种。

⒈液-液提取由于大多数药物都是有机化合物,并有不少为弱酸、弱碱。它们在pH不同的溶液中,将发生程度不等的解离。因此,应选用对待测物溶解度高、与所用标本不相混溶也不发生乳化的有机溶剂,并根据待测物的酸碱性和pKa,酸化或碱化样本,使待测物尽可能多地以脂溶性高的分子态存在,从而主要分配到有机溶剂中。这样处理,可使在此条件下极性高的干扰成分被排除。离心分离有机相和水相(样本),即可达到提取的目的。若必要,可按上述原理将待测成分再转提到pH适当的水相中,进一步排除高脂溶性的干扰物质。这类方法由于样本和提取介质均为液相,故称液-液提取。

⒉液-固提取又称固相柱提取,是近年发展的一种提取方法。可根据待测物的理化性质选用一合适的常压短色谱柱,TDM中常用疏水性填料柱。待标本(多经去蛋白处理)通过该柱后,以适当强度的溶剂洗脱,选择性收集含待测组分的洗脱液部分,即可达到较理想的提取目的。也可用强度不同的溶剂分次洗脱,仅收集洗脱待测组分。此类提取柱已有数种商品化生产,可供选用。本法虽比液-液提取繁琐,但回收率及提取特异性均高是其优点。

(三)化学衍生化反应

用光谱法和色谱法检测药物时,可根据待测物的化学结构和检测方法的要求,通过化学衍生化反应,特异性地引入显色(可见光分光法)、发光(紫外、荧光、磷光)基团,提高检测的灵敏度和特异性。气相层析时,常需使待测物硅烷化、烷化、卤化和酰化等,以增加待测物的热稳定性和挥发性,改善分离效果和适用于特殊的检测器。用高效液相色谱柱前衍生化分离测定手性异构体药物,则需在待测物中引入手性拆分基团。

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