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《动脉粥样硬化》 > 第二十二章 动脉粥样硬化模型及细胞培养

第五节 动脉平滑肌细胞的培养

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一、血管平滑肌细胞的培养

血管平滑肌细胞培养常用的方法有贴块法(explant)和酶解离法(enzyme disperse)。贴块法具有获得平滑肌细胞纯度高,量多,操作简便的优点。但用贴块法易使平滑肌细胞胞质内肌丝丧失,亚细胞器增加。相反,酶解离法,由于酶的作用使细胞间失去连接,细胞内肌丝含量丰富,保持收缩型状态。培养平滑肌细胞常取材于兔、猪、鼠、猴的胸腹主动脉段。

1.

方法:动物经颈动脉放血后,在无菌操作下迅速取出胸腹主动脉段,置于含Hank's液的平皿中漂洗3次,将凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层,然后纵行切开血管,刮除内膜即内皮细胞迅速撕下中膜内、中层,切成约1mm宽的小条,浸泡在含血清的Hank's液中,并将撕下小组织块种植于培养瓶壁。置于37℃恒温箱,2h左右,取出培养瓶加入20%胎牛血清的培养液,再放回培养箱内静止培养4天。4天后可见细胞从组织中迁移游出。

不同动物血管结构有差异,猪和猴较易操作,但小动物如兔、鼠因其血管小,血管壁薄等特点,使之难以分离。另外组织块太薄,不易粘附培养基,也使细胞较难生长。为了保证培养的成功,应注意:①种植组织块的数目,如75cm2的长颈瓶组织块不得少于30个;②根据培养细胞的种属加入适量的不同血清,一般可加入牛血清,若小牛血清增殖效果差,应加胎牛血清(FBS),通常浓度为10%~20%;③培养基的选择:常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium),M199培养基。培养兔的平滑肌细胞用DMEM效果较好。

2.酶解离法

沿动脉纵轴切开后,刮除内皮细胞撕下中膜的内2/3,注意不要混入内皮细胞,将组织块切成1-2mm2,放入加有3mg/ml胶原酶的无血清M199培养基中,37℃,0.5~1.5h。离心去上清,重复上述消化步骤,然后再离心(9000r,4min),收集细胞,在5%~10%同种血清或胎牛血清的M199培养基中调整细胞数,然后转入30~90mm培养皿中培养,对于兔子应加入高浓度的谷氨酰胺(0.2g/L)较佳。不同研究者在培养基、酶浓度以及消化时间等的选择都有很大的差异。

二、动脉平滑肌的特性

由于贴块法和解离法处理方式不同,在细胞培养的最初阶段细胞形态和性质存在差异。随着培养时间的延长,培养环境趋于一致,细胞特性上也趋于近似。

光学倒置显微镜下观察:原代平滑肌细胞形状多样,一般常为梭形、带形、三角形或星形。贴块法培养,细胞可于2周后长成单层;而酶解离只需6~7天,镜下可见明显“峰-谷”样生长。

透射电子显微镜下观察:贴块法,细胞多为合成型,肌丝减少,胞体缩小,细胞胞质内粗面内质网、游离核糖体、线粒体等亚细胞器逐渐增多。消化法,细胞初期表现为收缩型,细胞内核位于中心,胞质内含丰富的肌丝及致密度体。亚细胞器少,且位于细胞边缘处,基底膜最初未见,后来逐渐形成。传代后,细胞逐渐转为合成型,胞体增大且变扁平,核增大,核小体数目增加,亚细胞器也增加,肌丝开始减少,占胞内35.4%~11.5%,甚至更少。

另外,在体外实验中,来自幼龄动物(兔,猪)的血管平滑肌增殖生长早且快,相反,老龄动物则生长缓慢。在生化性质方面,收缩型细胞比合成型细胞的β-极密度脂蛋白(β-VLDL)对其受体结合能力强,低密度脂蛋白(LDL)分解降低,即脂质容易在胞质沉着。此外,像基底膜中的肝素样物质、胆固醇代谢等也有改变。合成型细胞内色素C氧化还原酶成倍增加,酸性磷酸酶亦呈3~4倍增加,说明这两类细胞不仅在形态学上,在生化、生理反应方面也发生了较大改变。

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