第二节 动脉血管壁细胞组分的提取

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一、血管壁细胞提取

1.以无菌术取动脉,立即放入4℃、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗,除去凝血。

2.用小镊剔除外膜纤维、脂肪组织,用剪子沿血管壁纵向剪开血管,用Hanks液洗2次。

3.可先分开内皮细胞和平滑肌细胞,也可不区分两类细胞,将血管切成小块,放入2%胶原酶,温浴12~18h。

4.梯度液选择40%~70%,40%梯度液应是4份precoll、1份小牛血清、5份BPS,其他浓度配制与此相同。

5.把密度梯度液按从管底至管口密度梯度逐渐减少的顺序铺入试管,将操作3.细胞液铺于顶层,4kr/min离心,收集各层细胞鉴定。

二、细胞核提取

1.取制备血管细胞悬液放于试管中,加五倍体积缓冲液(10mmol/l TrisHCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2),加1%SDS10 μl用匀浆器轻轻匀浆。

2. 加蔗糖液(0.34mol/L,蔗糖10mol/LMgCl2)2份再匀浆1次,下面铺一层0.88mol/L蔗糖,800g离心5min,收集沉淀部分。

3.在0.88mol/L蔗糖液中再纯化1次,然后将细胞悬于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中,用超声波处理10S。

4.将两倍体积的0.88mol/L蔗糖加于上述处理液中,800g离心30min收集沉淀部分。

5.将沉淀加入0.88mol/L蔗糖,5kg离心1h,沉淀部分为细胞核,将其保存于0.25mol/L蔗糖,0.55mmol/LMgCl中备用。

三、细胞膜的提取

1.取一定量酶处理的细胞,用匀浆器破碎,操作要温和,使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应,因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压,以每克细胞湿重加40ml介质。

2.用Potter-Elvehiem匀浆器,杆与壁间间隙0.5~0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4~6次,每次5S。

3.过滤匀浆液,150g离心10min,保留上清,沉淀部分加入50μl介质,用匀浆器1kr/min匀浆3次,150g离心10min,沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。

4.合并3次上清液,2kg离心10min,弃上清,沉淀部分溶于100μl介质,离心10min,弃上清,留沉淀。

5.将沉淀部分加入70%蔗糖15份,然后分别置于三个离心管中,上面依次叠加54%、49%、45%,41%,37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。

6.700kg离心90min,分离介质在1.16~1.18之间形成介面。

7.收集d为1.16~1.18g/ml之间的细胞膜,加30倍的介质以2.5kg离心10min,洗涤2次。

8.保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中,用于细胞膜的研究分析。

四、溶酶体的分离

1.在梯度混合器的两个小杯中分别加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖(比例9:1)。

2.收集血管壁细胞,用特制匀浆器1kr/min匀浆10次。

3.以150g离心10min,上清液以同样条件离心1次,弃沉淀,上清液以9kg离心3min弃上清液,

4.沉淀分三种不同颜色,褐色为半纯化的溶酶体,中间黄褐色为线粒体部分,上层白色为膜成分混合物。首先小心吸取上层,然后加入0.3mol/L蔗糖数毫升,慢慢摇匀使界面层悬浮,再用0.3mol/L蔗糖洗1次。

5.将悬浮的半纯化溶酶体铺在梯度平面上,用玻棒搅匀最上层梯度液,使溶酶体和梯度液之间的介面破坏,然后以10kg离心15min,离心后可出现三条明显的区带及少许沉淀,最下面黄褐色为纯化的溶酶体,中间黄色的为线粒体。

五、线粒体的分离

1.浆分离的血管浸入缓冲液(250mmol/L甘露醇、0.5mmol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4)匀浆破碎细胞,600g离心5min,除去细胞核及碎片。

2.上清液在100kg离心10min,留取沉淀部分。

3.将沉淀部分悬浮于5ml操作1.的缓冲液中,加入5倍体积30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L,EDTA、25mmol/LHepes 0.1%BSA,5000g离心30min。

4.将上述沉淀溶于适量10mmol/L KH2PO4,pH7.4中,轻轻振荡15min。

5.加入10ml蔗糖液缓冲液(32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl2、10mmol/L KH2PO4,pH7.4)振荡15min。

6.用BransonB-12超声波碎仪60~70W处理2次,每次15min,12kg离心10min。

7.将沉淀部分溶于10倍体积缓冲液中并铺于试管底层,试管中层铺成不连续蔗糖梯度(25.3%、37.9%和51.3%)蔗糖各4mm厚,上层铺上清液。

8.2kg离心3h,在25.3%/37.9%界面处为线粒体外膜,在51.3%蔗糖层分别回收内膜和基质。

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