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《动脉粥样硬化》 > 第十六章 血浆脂蛋白的分离纯化及定量

第一节 脂蛋白分离的方法学评价

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血浆脂蛋白和脂质测定是临床生化检验的常规测定项目,其临床意义主要是:①早期发现与诊断高脂蛋白血症;②协助诊断动脉粥样硬化症;③评价动脉粥样硬化疾患如冠心病脑梗塞等危险度;④监测评价饮食与药物治疗效果。

血浆脂蛋白测定分离的常用方法有超速离心法、沉淀分离法、电泳分离法及免疫分离法。根据脂蛋白分离纯化或定性定量等不同的需要可以选择不同的方法,如图16-1所示。

人血清脂蛋白的电泳和超速离心分离相应位置模式及名称比较图

图16-1 人血清脂蛋白的电泳和超速离心分离相应位置模式及名称比较图

一、超速离心法

超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白比重(密度)的差异,在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。

血浆在不同密度盐溶液中经过超速离心,各种脂蛋白按密度大小漂浮于不同盐溶液介质中。脂蛋白漂浮的恒量单位是漂浮率(Sf),Gofman等于1950年确定,血浆脂蛋白在比重为1.063的NaCl溶液中(26℃),每秒每达因克离心力的作用下的漂浮速度,称为1个Svedberg单位(10-13Sf)。Sf越大,脂蛋白密度越低。

一般操作方法是将血浆置于已准备好的不同密度梯度的盐溶媒介质中,在强大离心力作用下,各脂蛋白依其自身在不同分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层媒层,达到分离纯化的目的。

越速离心法是分离纯脂蛋白的有效技术,目前广泛应用于脂蛋白载脂蛋白代谢的研究中。

二、电泳分离法

不同脂蛋白因蛋白质含量不同,其荷电量不同,故可用电泳方法进行分离,并根据血浆脂蛋白的电泳迁移率不同予以判断、确认。电泳支持物一般常用醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。由于醋酸纤维薄膜要予处理,很繁杂,外加电泳时间过长,目前已很少使用。临床检验中主要采用琼脂糖凝胶电泳进行分离,快而较为准确,仪器设备要求不高,被广泛采用。聚丙烯酰胺凝胶作为支持物,分离脂蛋白,分离率高又准确,值得推荐给临床使用。

电泳分离法,不论用何种支持物,血浆脂蛋白需用亲脂染料如苏丹黑B等进行预染再电泳,电泳完毕,脂蛋白根据荷电量不同,其适移率不同,再置于光密度下进行扫描,计算出各种脂蛋白百分比,该数值乘以血浆总脂量,即可求出α-脂蛋白,β-脂蛋白和前β-脂蛋白含量。乳糜微粒停留在原点,无法测出其含量,正人空腹12h后,血浆中无CM存在。也可将电泳完毕的琼脂糖凝胶中的脂蛋白区带切割置于试管中,加水溶解,进行比色,测出各自百分比,但因其是手工半定量法,难以测准,属淘汰之列。

三、沉淀分离法

由于脂蛋白的组成及理化性质不同,在不同的聚阴离子和2价不同金属离子(Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+)以及不同pH值条件下,使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀,以达到分离定量各种脂蛋白的目的,如以肝素锰沉淀剂先沉淀血清中VLDL和LDL,离心,HDL在上清液里,再定量HDL量,即为血浆HDL的量。采用聚乙烯硫酸盐沉淀LDL,测定血浆的LDL量。

脂蛋白是一种既有蛋白质,又有胆固醇,还有磷脂的复合体,如何定量,目前尚无理想的方法。现在以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据。即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇,并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)或极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)。这类测定方法是目前临床广泛使用的快速并较为准确的方法。

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